Тема: Морфология и ультраструктура бактериальных клеток. Простые и сложные методы окраски Цель: Научиться окрашивать фиксированный препарат по Грану и изучать морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. Освоить постановку КОН-теста. Научиться готовить препараты типа "раздавленная капля".
Кокки – бактерии сферической формы диплококки стрептококки сарцины стафилококки
Бациллы Бактерии Клостридии
Вибрионы Спирохеты Спириллы
Актиномицеты
Подготовка стекла Приготовление мазка Высушивание Фиксация
Этап Вещество Время обработки Основной краситель Генцианвиолет ( кристаллвиолет ) 1 мин Фиксатор Р-р Люголя 1 мин Дифференцирующее вещество Спирт этиловый 96° 5-10 сек Промывка Вода 5-10 Сек Дополнительный краситель Водный фуксин 1 мин Промывка Вода 5-10 сек
Окраска по Граму Принцип метода. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой - грамотрицательных - мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель- пептидогликан -йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные - остаются окрашенные в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет. КОН - тест Принцип метода: В каплю 3% КОН вносят полную петлю исследуемой культуры. Растирают культуру петлей в течение 30 сек., периодически отрывая петлю от стекла. Щелочь разрушает клеточную стенку грамотрицательных бактерий, и клеточное содержимое выходит наружу, вследствие чего вязкость капли резко возрастает. Содержимое капли тянется за петлей до 3-10 мм. Грамположительные бактерии не лизируются и вязкость капли на стекле не изменяется.
Бактерии Грамположительные Грамотрицательные Структура клеточной стенки Пептидогликан Внешняя мембрана ( липополисахарид ) Тейхоевые кислоты Результат окраски по Грамму (рисунок) Гр(+) бактерии Гр(-) бактерии Смесь Гр(+) и Гр(-) бактерий Результат КОН - теста
Органоид Функция Метод выявления Облигатные органоиды Клеточная стенка Защитная, регуляция роста и деления клетки, антигенная, рецепторная, структурная По Граму Цитоплазматическая- мембрана Барьерная, энергетическая, транспортная, рецепторная, ферментативная, маркировка клетки По Цилю-Нельсену Нуклеоид эквивалент ядра, з десь находится генетический материал хранение наследственной информации по Фельгену или по Романовскому— Гимзе. Рибосомы органоиды, осуществляющие биосинтез белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации. - Мезосомы участвуют в образовании клеточных перегородок, к ним прикрепляется ДНК нуклеоидов По Нейссеру
Факультативные органоиды Пили Половые Пили фимбрии – размножение, коньюгация Соматические пили – адгезия, питание, водно-солевой обмен. - Жгутики определяют подвижность бактериальной клетки По Морозову Капсула предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, так как, являясь гидрофильными, хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизма и бактериофагов Окраска по Бурри-Гинсу Спора образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий, у некоторых видов служат для размножения окрашиваются по методу Ожешко, Ауески или по методу Циля — Нельсена в красный, а вегетативная клетка — в синий. Плазмиды внехромосомные факторы наследственности по Фельгену или по Романовскому— Гимзе. Включения Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей. окрашивание по Нейссеру, Толуидиновым синим или метиленовым голубым
Этап Вещество Время обработки Негативное контрастирование (по Бурри) Черная тушь (смешивается с исследуемой культурой и высушивается) Фиксация В пламени спиртовки Окраска микробных клеток (по Гинсу) Водный фуксин 1 мин Промывка Вода 5-10 секунд Принцип метода: Капсула не воспринимает красители, поэтому ее выявляют, создавал в препарате черный тушевой фон (метод Бурри ). Дополнительная окраска тела микробной клетки позволяет визуализировать капсулу (метод Бурри-Гинса ).
Этап Вещество Время обработки Основной краситель Карболовый фуксин Циля 3-5 мин при нагревании Дифференцирующее вещество Р-р серной кислоты 1-2 мин Промывка Вода 5-10с Дополнительный краситель Метиленовый синий 3-5 мин Промывка Вода 5-10с Принцип метода: Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.
Этап Вещество Время обработки Протравливание Р-р соляной кислоты 2-3 мин при нагревании Промывка Вода 5-10с Фиксация В пламени спиртовки Основной краситель Карболовый фуксин Циля 3-5 мин при нагревании Дифференцирующее вещество Р-р серной кислоты; 1-2 мик Промывка Вода 5-10с Дополнительный краситель Метиленовый синий 3*5 мин Промывка Вода 5-Юс Принцип. Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, ко отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.
Этап Вещество Время обработки Основной краситель Уксуснокислый метиленовый синий Нейссера 2-3 мин Дифференцирующее вещество Вода 5-10с Дополнительный краситель Везувии 1 мин Промывка Вода 5-Юс Принцип метода: При окраске метиленовым синим. образуется нерастворимый в воде комплекс: краситель + волютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы волютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем докрашивается везувином в желтый цвет.
совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий (микробов) в лабораторной культуре, патологическом материале или в пробах из внешней среды с помощью микроскопии. Применяют для установления диагноза инфекционного. заболевания или иного вызванного микробами процесса, а также при идентификации выделенной чистой культуры. Сфера применения: Метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическими, тинкториальными свойствами и типичной локализацией в организме. Например: гонорея, сифилис, возвратные тифы, туберкулез, некоторые микозы.
Достоинства: 1) 2) 3) Недостатки: 1) 2) 3)
Slide-Share