Презентация: ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.

ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Будова активного центру антитіл Нековалентні зв ’ язки між антитілом та антигеном ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа Розрахунок афінності антитіл ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа Кінетичні розрахунки При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ] ' з, при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ] з /2. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену ; n - кількість центрів зв'язування антитіл Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ. Методи імунохімічного аналізу Чутливість різних імунохімічних методів досліджень Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κ а = В / F · ( n –B) Рівноважний діаліз РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ Характеристика антигенів і антитіл, що утворюють комплекси в реакціях преципітації і аглютинації Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл Співвідношення концентрацій антиген ів і антитіл, коли спостерігається утв о рення максимального осаду ( преципітату ), називається точкою еквівалентності ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакція преципітації в рідкій фазі Реакції преципітації в гелі Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні. Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія. Імуноелектрофорез ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакції (гем)аглютинації ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Методи аглютинації ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Конкурентні імунохімічні методи Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and labeled antigen РІА р адіоімунний аналіз Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для Р І А: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції Різні методи побудови калібрувальних кривих Різні методи побудови калібрувальних кривих РІА радіоімун - ний аналіз В - рівень зв ’ язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125 І-АГ; В 0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125 І-АГ, внесений в пробірку Естріол – РІА метод ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. C кринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Групи методів в імуноферментному аналізі КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ ( б) ГЕТЕРОГЕННИЙ І МУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз Кон ’ югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон ’ югату - комплексу антигену і фермента методом гібридних антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл. ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Різновиди методу ELISA ELIS А- E nzyme- L inked I mmunoSorbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод Метод визначення антитіл (непряма ELISA) ELISA : 1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену Метод визначення антигенів Будова вірусу імунодефіциту людини Хибно-позитивні результати “ For instance, some, but not all, people who have had blood transfusions, prior pregnancies or an organ transplant will make HLA ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Positive ELISA Test ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2 (1999) Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- С ell Death Detection ELISA PLUS Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA p53 pan ELISA-о ne-step immunoreaction – Photometric enzyme immunoassay for the quantification of p53 in cells, homogenates, plasma, or serum Метод імунофлуоресценції Флуоресцентне випромінювання ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Fluorescence spectra of commonly used fluorochromes. Excitation spectra is represented by the gray lines while emission spectra is in black. The bottom part of ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм Метод імунофлуоресценції Протоковий цитофлуориметр (клітинний сортер) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Св і т л о розсіювання ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Пряме с в і т л о розсіювання Б ічне с в і т л о розсіювання Протокова цитометрія Флуоресценція при протоковій цито(флуоро) метр ії та методи її реєстрації Виокремлення популяції лімфоцитів Необхідно мати суспензію лімфоцитів; антитіла до CD 8, мічені флуоресцентним барвником. На трьохмірній діаграмі (рис. б) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів ІМУНОБЛОТИНГ ( Western blotting ) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Будова вірусу імунодефіциту людини ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Визначення присутності грампозитивних бактерій класу спірохет Borrelia burgdorferi, які спричиняють хворобу Лайма, методом імуноблотингу ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Метод ELISPOT а) методичний підхід, б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів Метод ELISPOT ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.
1/120
Средняя оценка: 4.1/5 (всего оценок: 47)
Скачать (29817 Кб)
Код скопирован в буфер обмена
1

Первый слайд презентации: ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.

2

Слайд 2: Будова активного центру антитіл

3

Слайд 3: Нековалентні зв ’ язки між антитілом та антигеном

4

Слайд 4

5

Слайд 5: АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

6

Слайд 6: (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа швидкості асоціації; κ 2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V 1 = k 1 ·[ АГ ] · [ АТ ] V 2 = k 2 · [ АГАТ ] За умов рівноваги, коли V 1 = V 2, можна записати: k 1 · [ АГ ][ АТ ] = k 2 · [ АГАТ ] Константа афінності (2)

= = , М -1 або л/моль

7

Слайд 7: Розрахунок афінності антитіл

8

Слайд 8

K d =1/ K a - константа дисоціації ; K a >10 5 M -1 - c пецифічне зв′язування ; K a >10 8 M -1 - високоспецифічне зв′язування; K a <10 5 M -1 - низькоспецифічне (антитіла проти вуглеводів) K a - термодинамічний параметр: Δ F= - R T ln K a, де R - газова постійна; T - абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

9

Слайд 9: (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа швидкості асоціації; κ 2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V 1 = k 1 ·[ АГ ] · [ АТ ] V 2 = k 2 · [ АГАТ ] За умов рівноваги, коли V 1 = V 2, можна записати: k 1 · [ АГ ][ АТ ] = k 2 · [ АГАТ ] Константа афінності (2)

= = , М -1 або л/моль

10

Слайд 10: Кінетичні розрахунки

Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу [АТ] з = [АТ] +[ АГ·АТ ] [АГ ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3), де [АТ] з і [АГ] з - загальна концентрація АТ і АГ, [ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ, [АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4) [ АГ·АТ ] = к а [АТ] з [АГ] / 1+ к а [АГ] За умови - [АГ] з >> [АТ] з, отримуємо (5) [ АГ·АТ ]= к а [АТ] з · [АГ] з / 1+ к а [АГ] з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен; при високих концентраціях [АГ] з [АГ·АТ] = [АТ] з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

11

Слайд 11: При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ] ' з, при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ] з /2. Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ] з '=1/ к а +[АТ] з /2

12

Слайд 12

13

Слайд 13: Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену ; n - кількість центрів зв'язування антитіл

[АГ·АТ] / [АГ]= к а [АТ] з - к а [АГ·АТ] = = к а ( [АТ] з -[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

14

Слайд 14: Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

15

Слайд 15: Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

16

Слайд 16

17

Слайд 17: МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

18

Слайд 18: Методи імунохімічного аналізу

Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація). Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації. Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д. Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

19

Слайд 19: Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

20

Слайд 20: Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах

Методичні підходи, що засновані на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів (антитіл) під час утворення комплексу: зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д. Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

21

Слайд 21: Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κ а = В / F · ( n –B)

22

Слайд 22: Рівноважний діаліз

23

Слайд 23: РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

24

Слайд 24: Характеристика антигенів і антитіл, що утворюють комплекси в реакціях преципітації і аглютинації

25

Слайд 25: Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл

26

Слайд 26: Співвідношення концентрацій антиген ів і антитіл, коли спостерігається утв о рення максимального осаду ( преципітату ), називається точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності.

27

Слайд 27

28

Слайд 28: Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга.

29

Слайд 29

30

Слайд 30: Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості. Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

31

Слайд 31

32

Слайд 32: Реакція преципітації в рідкій фазі

33

Слайд 33: Реакції преципітації в гелі

34

Слайд 34: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

35

Слайд 35

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність даного антигена

36

Слайд 36: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена

37

Слайд 37: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

38

Слайд 38

Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

39

Слайд 39: Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

40

Слайд 40: Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія.

41

Слайд 41: Імуноелектрофорез

42

Слайд 42

43

Слайд 43

44

Слайд 44: Реакції (гем)аглютинації

Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості.

45

Слайд 45

46

Слайд 46

47

Слайд 47: Методи аглютинації

48

Слайд 48

49

Слайд 49: Конкурентні імунохімічні методи Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and labeled antigen

50

Слайд 50: РІА р адіоімунний аналіз

В основі класичного РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену за зв ’ язування зі специфічними антитілами

51

Слайд 51: Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для Р І А: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції зв'язування міченого і не міченого антигену і визначення концентрації досліджуваного антигену X ( [АГ]х )

52

Слайд 52: Різні методи побудови калібрувальних кривих

53

Слайд 53: Різні методи побудови калібрувальних кривих

54

Слайд 54: РІА радіоімун - ний аналіз

55

Слайд 55: В - рівень зв ’ язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125 І-АГ; В 0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125 І-АГ, внесений в пробірку Естріол – стероїдний гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

56

Слайд 56: РІА метод

57

Слайд 57

Прикладом використання РІА можуть бути методи для тестування алергійних станів у людини

58

Слайд 58: C кринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

59

Слайд 59: ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

60

Слайд 60

61

Слайд 61: Групи методів в імуноферментному аналізі

62

Слайд 62: КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ ( б) ГЕТЕРОГЕННИЙ І МУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

63

Слайд 63: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Імуносорбенти Твердофазні носії Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій фазі Ферменти і субстрати Кон ’ югати та їх створення

64

Слайд 64: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Ферменти і субстрати Пероксидаза хрону (ПХ)-Н orse radish peroxidase ( HRP). Субстрати при фотометрії - тетраметилбензидин ( англ. TMB ) та ABTS ( 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії – паранітрофенілфосфат Галактозидаза - субстрат при фотометрії – нітрофенілгалактозид

65

Слайд 65: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISA

66

Слайд 66: Кон ’ югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин)

Система “антит і ло - б і отин + ( стрепт ) ав і дин + м і чен ий б і отин” Система “ антиген +антит і ло - б і отин + м і чен ий ст р ептавідин ”

67

Слайд 67

68

Слайд 68: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон ’ югату - комплексу антигену і фермента методом гібридних антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло класу G: дія папаїну і пепсину.

69

Слайд 69: Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл.

70

Слайд 70: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

71

Слайд 71: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISA

72

Слайд 72

73

Слайд 73

ПРЯМА ELIS А

74

Слайд 74: Різновиди методу ELISA

75

Слайд 75: ELIS А- E nzyme- L inked I mmunoSorbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод

What you need to do the assay Purified antigen (if you want to detect or quantify antibody). Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen). Standard solutions (positive and negative controls). Sample to be tested. Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done. Wash fluid (buffer). Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate. ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

76

Слайд 76: Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

77

Слайд 77: ELISA : 1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену

1 варіант конкурентної ELISA 2 варіант цього ж методу 1 2

78

Слайд 78: Метод визначення антигенів

79

Слайд 79: Будова вірусу імунодефіциту людини

80

Слайд 80: Хибно-позитивні результати “ For instance, some, but not all, people who have had blood transfusions, prior pregnancies or an organ transplant will make HLA antibodies. And some, but not all, test kits (both ELISA and Western blot) will be contaminated with HLA antigens to which these antibodies can react. Only if these two conditions coincide might you get a false-positive due to HLA cross-reactivity ”.

В і р і он и В ІЛ м а ют ь вид сферичних част очок, д і аметр яких складає приблизно 100—120 нм. Оболонка утворена подвійним шаром ліпідів і містить ряд білків, її походження - від зовнішньої мембрани клітини-господаря. Отже, відбруньковуючись, вірус може захопити частину зовнішньої мембрани клітини-господаря, що містить “експресовані” на ній молекули МНС, а саме людські лейкоцитарні антигени HLA класів I, II і молекули адгезії. Завдяки цьому певна частина пацієнтів, які проходять тест на наявність антитіл до ВІЛ з використанням методу ELISA, може мати хибно-позитивні результати ( false positive ), оскільки мають антитіла проти молекул HLA, які також є на мембрані клітини-хазяїна (0,02-0,5%). Хибно-негативні ( false negative ) результати можуть бути отримані, якщо сироватки пацієнтів були в стадії сероконверсії – зазору = віконця ( window ) у часі між інфікуванням і напрацюванням специфічних антитіл до вірусу ( 3 — 5%). Хибно-позитивні результати “ For instance, some, but not all, people who have had blood transfusions, prior pregnancies or an organ transplant will make HLA antibodies. And some, but not all, test kits (both ELISA and Western blot) will be contaminated with HLA antigens to which these antibodies can react. Only if these two conditions coincide might you get a false-positive due to HLA cross-reactivity ”.

81

Слайд 81

ELISA Activity ( n_animation.mov, p_animation 1.mov) An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA) is the first and most basic test to determine if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed. Plate ELISA

82

Слайд 82

The ELISA Method ( n_animation.mov, p_animation 1.mov) Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

83

Слайд 83: Positive ELISA Test

Negative ELISA Test

84

Слайд 84

Positive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical density at 450 nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis ELISA Activity ELISA data from three patients

85

Слайд 85: Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2 (1999)

86

Слайд 86: Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- С ell Death Detection ELISA PLUS Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA

87

Слайд 87: p53 pan ELISA-о ne-step immunoreaction – Photometric enzyme immunoassay for the quantification of p53 in cells, homogenates, plasma, or serum

Contents Anti-human-p53 pan-peroxidase (POD), polyclonal from sheep, lyophilizate Human p53 standards, lyophilized (six vials, from 0 pg/ml up to 1,200 pg/ml; see lot-specific data) Incubation Buffer/Sample Diluent, 50 ml, ready-to-use solution 10x Washing Buffer, 100 ml TMB Substrate Solution, 26 ml, ready-to-use TMB Stop Solution, 8 ml, ready-to-use Streptavidin-coated Microplate, 96-well; 8-well modules in a frame, precoated with anti-p53-biotin monoclonal antibody from mouse Self-Adhesive Plate Cover Foils, 2 foils Principle The p53 pan ELISA assay is based on the quantitative “sandwich enzyme-immunoassay” principle using two monoclonal antibodies directed against human p53. During a one-step incubation in the precoated wells of the microplate, p53 from the sample binds to the plate surface, and the peroxidase (POD)-conjugated detection antibody interacts with the immobilized p53. Following a washing step, the POD bound within the “sandwich” complex is detected with the colorimetric substrate tetramethylbenzidine (TMB), and levels are spectrophotometrically determined. The kit provides standards with defined concentrations of p53, allowing for the creation of a standard calibration curve; unknown sample values are calculated from this plot. Figure 1: Test principle. Typical Experiment Figure 2: Typical standard curve, plotted with each experiment, and used for the calibration of prediluted serum samples.

88

Слайд 88: Метод імунофлуоресценції

89

Слайд 89: Флуоресцентне випромінювання

Деякі речовини здатні поглинати фотони певної енергії (довжини хвилі) при опроміненні світлом певної довжини хвилі. Світло (фотони), що випромінюється ними потім, має нижчу енергію й, отже, більшу довжину хвилі і в зв’язку з цим інший колір c вітла. Таким чином виділяють хвилю збудження (excitation) або спектр поглинання та хвилю випромінення=емісії (emission =испускать = emit). Таке випромінювання світла називається флуоресценцією.

90

Слайд 90

В 1944 р. Albert Coons показав, що антитіла можна мітити молекулами, які флуоресціюють. Коли молекула антитіла зв’язується з флуоресцентним барвником (флуорохромом), імунний комплекс, що містить це мічене антитіло, можна детектувати за рахунок емісії після збудження світлом певної довжини хвилі. Цю детекцію (світло, яке випромінюють після збудження флуорохроми) проводять з використанням флуоресцентного мікроскопа, який має у своєму складі джерело УФ – випромінення, або проточного цитофлуориметра, що містить лазер. Саме такий підхід отримав загальну назву “Методи з використанням імунофлуоресценції ”.

91

Слайд 91: Fluorescence spectra of commonly used fluorochromes. Excitation spectra is represented by the gray lines while emission spectra is in black. The bottom part of the table summarizes the emission wavelengths of various light sources used in flow cytometry. The 488nm line of the argon ion laser is extended over the spectra. (From Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro. P. 245).

92

Слайд 92

Флуоресцеїн ( Fluorescein )- органічний барвник, який широко використовують в імунофлуоресценції. Хвиля збудження в діапазоні синього світла (490 нм) і емісії- зелено-жовтому діапазоні (517 нм). Флуоресцеїн - ізотіоціанат (ФІТЦ), Fluorescein isothiocyanate(FITC) похідне флуоресцеїну, широко використовується як флуоресцентний барвник. ФІТЦ збуджується синім світлом (494-495 нм) і випромінює в зелено-жовтому діапазоні (518- 521 нм ). Родамін ( Rhodamine ) - органічний барвник, збуджується в жовто-зеленому діапазоні (515 нм) і випромінює в червоному діапазоні (546 нм ). Оскільки його хвиля емісії лежить в більш довгохвильовому діапазоні, то саме він може бути використаним в імунофлуоресцентному аналізі з застосуванням двох барвників. Так, антитіло, специфічне до однієї антигенної детермінанти, мітиться флуоресцеїном, в той час як інше- родаміном. Локалізацію флуоресцеїн- міченого антигену візуалізують в жовто-зеленому діапазоні, і її легко відрізнити від емісії в червоному діапазон при зв’язуванні антигену з міченими родаміном антитілами. Саме таким чином можна візуалізувати два різних мембрано-зв’язані антигени на поверхні однієї і тієї ж клітини. Фікоеритрин (Phycoerythrin= PE ) – високофлуоресцентний пігмент, який отримують з водоростей, хвиля збудження -565 нм - синя область, емісії- 575 нм - червона область спектра. Його вважають ~ в 30 раз ефективнішим, ніж флуоресцеїн. DAPI - 4,6- diamedine -2- phenylindole - dihydrochloride – хвиля збудження/емісії- 358/461нм- ДНК-звязуючий барвник, ядра яскраво блакитні. Пропідій йодид (РІ)- хвиля збудження/емісії- 535/617 нм - ДНК-звязуючий барвник, ядра червоні.

93

Слайд 93: Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

94

Слайд 94: Метод імунофлуоресценції

95

Слайд 95: Протоковий цитофлуориметр (клітинний сортер)

96

Слайд 96

Протоковий цитофлуориметр (клітинний сортер)

97

Слайд 97

Протоковий цитофлуориметр

98

Слайд 98: Св і т л о розсіювання

Кл і т ини, які проходя ть через лазерн и й промінь, р озсіюють ( відбивають ) св ітло Т і нь, яку створює клітина, називається прямим світлорозсіюванням Також можливе розсіювання в інших напрямах Детектор и, які реєструють пряме світлорозсіювання ( FS S – Forward S catte r Sensor), розташовані навпроти лазерного променя, а ті, що реєструють бічне світлорозсіювання ( S SS – Side S catte r Sensor), – під кутом 90° до лазерного променя

99

Слайд 99

FS Sensor Пряме світлорозсіювання (розмір частинки) SS Sensor Бічне світлорозсіювання (гранульованість частинки) Лазер

100

Слайд 100: Пряме с в і т л о розсіювання

По значенню с игнал у прямого с в і т л ор озсівання можн а оцінити розмір ( тобто об' є м) кл і т ин и Великі клітини, наприклад, нейтрофіли, відкидають великі тіні; у менших по розміру клітин, наприклад, лімфоцитів, і тіні менші.

101

Слайд 101: Б ічне с в і т л о розсіювання

Б ічне с в і т л ор озсіювання, або ортогональне, є мірою неоднорідності внутрішньої структури клітини (наприклад, зернистості цитоплазми) Нейтрофіли з сегментованим ядром і високогранулярною цитоплазмою характеризуються високими показниками бічного с в і т л ор озсіювання Лімфоцити, які характеризуються високим ядерно-цитоплазматичним співвідношенням (невисокий вміст цитоплазми), мають нижчі показниками бічного світлорозсіювання

102

Слайд 102: Протокова цитометрія

103

Слайд 103: Флуоресценція при протоковій цито(флуоро) метр ії та методи її реєстрації

При прото ковій цитофлуориметр ії кл ітини мітять одним чи декількома ми флуорохромами. Випромінення кожного флуорохрому можливо зареєструвати окремо, використовуючи відповідні фільтри. Детектор и флуоресценц ії розташовані під кутом 90° до осі променя поряд з детекторами бічного світлорозсіювання. Мо же працювати від 2 до 13 детектор і в флуоресценц ії ( FLS = Fluorescence light Sensor ). Ці детектор и с кладаються з фото е лектронн и х помножувачів (ФЕУ), що під сил юю ют ь низ ькі сигнал и флуоресценц ії клітин, які мечен і флуоресцентно.

104

Слайд 104: Виокремлення популяції лімфоцитів Необхідно мати суспензію лімфоцитів; антитіла до CD 8, мічені флуоресцентним барвником. На трьохмірній діаграмі (рис. б) показані розміри ( s ), число ( n ) і флуоресценцію ( f ) лімфоцитів цілої клітинної популяції і популяції CD 8+, які отримані на клітинному сортері з використанням анти- CD 8 антитіл

105

Слайд 105

106

Слайд 106: Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

Анексин V ФІТЦ (-) / пропідій йодид (-), % Анексин V ФІТЦ (+) / пропідій йодид (-), % Анексин V ФІТЦ (+) / пропідій йодид (+), % Мертві клітини, % Контроль (А) 92,66 4,31 2,89 0,14 30 хв після опромінення (Б) 91,43 5,72 2,69 0,17 3 год після опромінення (В) 83,17 13,97 2,67 0,19

107

Слайд 107: ІМУНОБЛОТИНГ ( Western blotting )

108

Слайд 108

109

Слайд 109: Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

110

Слайд 110: Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі

Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL - метод ( Enhanced Chemiluminescence ). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню, що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

111

Слайд 111: Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals

The virus is dissociated into its constituent proteins by treatment with the detergent SDS, and its proteins are separated using SDS-PAGE. The separated proteins are transferred to a nitrocellulose sheet and reacted with the test serum. Anti-HIV antibodies in the serum bind to the various HIV proteins and are detected with enzyme-linked anti-human immunoglobulin, which deposits colored material from a colorless substrate. This general methodology will detect any combination of antibody and antigen and is used widely, although the denaturing effect of SDS means that the technique works most reliably with antibodies that recognize the antigen when it is denatured. Застосування імуноблотингу ( Western blotting ) для виявлення антитіл до ВІЛ

112

Слайд 112: Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject

113

Слайд 113

Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ, 1991) рекомендует следующую оценку результатов исследований, проведенных методом ИБ, а именно наличие полос на определённых участках нитроцеллюлозной пластины,что подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ : Положительный результат — обнаружение в сыворотке антител к двум вирусным белкам из группы env ( gp41 -TM, transmembrane; gp120 - SU, surface; gp 160 - SU; gp 36 –SU, характерный для ВИЧ-2) с наличием или отсутствием белков — продуктов других структурных генов gag ( p24 - CA, capsid) и pol (р31- І nt, integrase). Отрицательный результат — отсутствие антител к вирусоспецифическим белкам; Неопределенный результат — обнаружение в сыворотке антител к белкам из групп gag или pol. Трактовка результата.. При исследовании методом ИБ обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для ИБ на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата.

114

Слайд 114: Будова вірусу імунодефіциту людини

115

Слайд 115

Band pattern Interpretation Lane 1, HIV+ serum (positive control) Lane 2, HIV- serum (negative control) Lane A, Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C No bands present Negative Bands at either gp160 or gp120 and bands present at either p31 or p24 Positive Bands present, but pattern does not meet criteria for positivity Indeterminate

116

Слайд 116: Визначення присутності грампозитивних бактерій класу спірохет Borrelia burgdorferi, які спричиняють хворобу Лайма, методом імуноблотингу

117

Слайд 117

118

Слайд 118: Метод ELISPOT а) методичний підхід, б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів

119

Слайд 119: Метод ELISPOT

The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN- γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots..

120

Последний слайд презентации

Похожие презентации

Ничего не найдено