Презентация: ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.

ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Будова активного центру антитіл Нековалентні зв ’ язки між антитілом та антигеном ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа Розрахунок афінності антитіл ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Кінетичні розрахунки При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ] ' з, при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ] з /2. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену ; n - кількість центрів зв'язування антитіл Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ. Методи імунохімічного аналізу Чутливість різних імунохімічних методів досліджень Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κ а = В / F · ( n –B) Рівноважний діаліз РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ Характеристика антигенів і антитіл в реакціях преципітації і аглютинації Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл Співвідношення концентрацій антиген ів і антитіл при якому спостерігається утв о рення максимального осаду ( преципітату ), називається точкою еквівалентності ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації ( реакції ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакція преципітації в рідкій фазі Реакції преципітації в гелі Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність даного антигена Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні. Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія. Імуноелектрофорез ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Реакції гемаглютинації та аглютинації ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Методи аглютинації ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. РІА р адіоімунний аналіз Індикаторні імунохімічні методи, засновані на використанні різних міток Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and РІА р адіоімунний аналіз Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для Р І А: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції Різні методи побудови калібрувальних кривих Різні методи побудови калібрувальних кривих РІА радіоімун - ний аналіз В - рівень зв ’ язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125 І-АГ; В 0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125 І-АГ, внесений в пробірку Естріол – РІА метод ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. C кринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА Імуноферментний аналіз ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Групи методів в імуноферментному аналізі Варианты гомогенного иммуноферментного анализа А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ ( б) ГЕТЕРОГЕННИЙ І МУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз Кон ’ югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон ’ югату - комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл. ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Різновиди методу ELISA ELIS А- E nzyme- L inked I mmunoSorbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод Метод визначення антитіл (непряма ELISA) ELISA : 1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену Метод визначення антигенів Будова вірусу імунодефіциту людини ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Positive ELISA Test ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2 Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- С ell Death Detection ELISA PLUS Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм Метод імунофлуоресценції Проточний цитофлуориметр (клітинний сортер) Проточна цитометрія Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ІМУНОБЛОТИНГ ( Western blotting ) ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Використання хемілюмінесцентних підходів в імуноблот -аналізі Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject Будова вірусу імунодефіциту людини ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ. Метод ELISPOT а) методичний підхід,б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів Метод ELISPOT ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.
1/107
Средняя оценка: 4.7/5 (всего оценок: 63)
Скачать (29417 Кб)
Код скопирован в буфер обмена
1

Первый слайд презентации: ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ.

2

Слайд 2: Будова активного центру антитіл

3

Слайд 3: Нековалентні зв ’ язки між антитілом та антигеном

4

Слайд 4

5

Слайд 5: АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

6

Слайд 6: (1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [ АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ 1 - константа швидкості асоціації; κ 2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V 1 = k 1 ·[ АГ ] · [ АТ ] V 2 = k 2 · [ АГАТ ] За умов рівноваги, коли V 1 = V 2, можна записати: k 1 · [ АГ ][ АТ ] = k 2 · [ АГАТ ] Константа афінності (2)

= = , М -1 або л/моль

7

Слайд 7: Розрахунок афінності антитіл

8

Слайд 8

K d =1/ K a - константа дисоціації ; K a >10 5 M -1 - c пецифічне зв′язування ; K a >10 8 M -1 - високоспецифічне зв′язування; K a <10 5 M -1 - низькоспецифічне (антитіла проти вуглеводів) K a - термодинамічний параметр: Δ F= - R T ln K a, де R - газова постійна; T - абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

9

Слайд 9: Кінетичні розрахунки

Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу [АТ] з = [АТ] +[ АГ·АТ ] [АГ ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3), де [АТ] з і [АГ] з - загальна концентрація АТ і АГ, [ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ, [АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4) [ АГ·АТ ] = к а [АТ] з [АГ] / 1+ к а [АГ] За умови - [АГ] з >> [АТ] з, отримуємо (5) [ АГ·АТ ]= к а [АТ] з [АГ] з / 1+ к а [АГ] з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен; при високих концентраціях [АГ] з [АГ·АТ] = [АТ] з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

10

Слайд 10: При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ] ' з, при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ] з /2. Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ] з '=1/ к а +[АТ] з /2

11

Слайд 11

12

Слайд 12: Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену ; n - кількість центрів зв'язування антитіл

[АГ·АТ] / [АГ]= к а [АТ] з - к а [АГ·АТ] = = к а ( [АТ] з -[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

13

Слайд 13: Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

14

Слайд 14: Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

15

Слайд 15

16

Слайд 16: МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

17

Слайд 17: Методи імунохімічного аналізу

Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація). Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації. Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д. Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

18

Слайд 18: Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

19

Слайд 19: Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах

Методичні підходи, що засновані на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів чи антитіл під час утворення комплексу: зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д. Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

20

Слайд 20: Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κ а = В / F · ( n –B)

21

Слайд 21: Рівноважний діаліз

22

Слайд 22: РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

23

Слайд 23: Характеристика антигенів і антитіл в реакціях преципітації і аглютинації

24

Слайд 24: Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл

25

Слайд 25: Співвідношення концентрацій антиген ів і антитіл при якому спостерігається утв о рення максимального осаду ( преципітату ), називається точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності

26

Слайд 26

27

Слайд 27: Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга.

28

Слайд 28

29

Слайд 29: Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації ( реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д) реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

30

Слайд 30

31

Слайд 31: Реакція преципітації в рідкій фазі

32

Слайд 32: Реакції преципітації в гелі

33

Слайд 33: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

34

Слайд 34

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність даного антигена

35

Слайд 35: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність даного антигена

36

Слайд 36: Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

37

Слайд 37

Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

38

Слайд 38: Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

39

Слайд 39: Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія.

40

Слайд 40: Імуноелектрофорез

41

Слайд 41

42

Слайд 42

43

Слайд 43: Реакції гемаглютинації та аглютинації

44

Слайд 44

45

Слайд 45

46

Слайд 46: Методи аглютинації

47

Слайд 47

48

Слайд 48: РІА р адіоімунний аналіз

Roger Guillemin Andrew V. Schally Rosalyn Yalow The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977 was divided, one half jointly to Roger Guillemin and Andrew V. Schally "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain" and the other half to Rosalyn Yalow "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones".

49

Слайд 49: Індикаторні імунохімічні методи, засновані на використанні різних міток Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and labeled antigen

50

Слайд 50: РІА р адіоімунний аналіз

В основі РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену за зв ’ язування зі специфічними антитілами

51

Слайд 51: Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для Р І А: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції зв'язування міченого антигену не міченим і визначення концентрації 'антигену X

52

Слайд 52: Різні методи побудови калібрувальних кривих

53

Слайд 53: Різні методи побудови калібрувальних кривих

54

Слайд 54: РІА радіоімун - ний аналіз

55

Слайд 55: В - рівень зв ’ язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125 І-АГ; В 0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125 І-АГ, внесений в пробірку Естріол – стероїдний гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

56

Слайд 56: РІА метод

57

Слайд 57

58

Слайд 58: C кринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

59

Слайд 59: Імуноферментний аналіз

60

Слайд 60

61

Слайд 61: Групи методів в імуноферментному аналізі

62

Слайд 62: Варианты гомогенного иммуноферментного анализа А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело

63

Слайд 63: КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ ( б) ГЕТЕРОГЕННИЙ І МУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

64

Слайд 64: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Імуносорбенти Твердофазні носії Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій фазі Ферменти і субстрати Кон ’ югати та їх створення

65

Слайд 65: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Ферменти і субстрати Пероксидаза хрону (ПХ)-Н orse radish peroxidase ( HRP). Субстрати при фотометрії - тетраметилбензидин ( англ. TMB ) та ABTS ( 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії – паранітрофенілфосфат Галактозидаза - субстрат при фотометрії – нітрофенілгалактозид

66

Слайд 66: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISA

67

Слайд 67: Кон ’ югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин)

Система “антит і ло - б і отин + ( стрепт ) ав і дин + м і чен ий б і отин” Система “ антиген +антит і ло - б і отин + м і чен ий стептавідин ”

68

Слайд 68

69

Слайд 69: ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон ’ югату - комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло класу G: дія папаїну і пепсину.

70

Слайд 70: Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл.

71

Слайд 71: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

72

Слайд 72: ELIS А- E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISA

73

Слайд 73

74

Слайд 74

ПРЯМА ELIS А

75

Слайд 75: Різновиди методу ELISA

76

Слайд 76: ELIS А- E nzyme- L inked I mmunoSorbent A ssay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод

What you need to do the assay Purified antigen (if you want to detect or quantify antibody). Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen). Standard solutions (positive and negative controls). Sample to be tested. Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done. Wash fluid (buffer). Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate. ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

77

Слайд 77: Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

78

Слайд 78: ELISA : 1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену

1 варіант конкурентної ELISA 2 варіант цього ж методу 1 2

79

Слайд 79: Метод визначення антигенів

80

Слайд 80: Будова вірусу імунодефіциту людини

81

Слайд 81

В і р і он и В ІЛ м а ют ь вид сферичних част очок, д і аметр яких складає приблизно 100—120 нм. Оболонка утворена подвійним шаром ліпідів і містить ряд білків, її походження - від зовнішньої мембрани клітини-господаря. Отже, відбруньковуючись, вірус може захопити частину зовнішньої мембрани клітини-господаря, що містить “експресовані” на ній молекули МНС, а саме HLA класів I і II та молекули адгезії. Завдяки цьому певна частина пацієнтів, які проходять тест на наявність антитіл до ВІЛ з використанням методу ELISA, може мати хибно-позитивні результати ( false positive ), оскільки мають антитіла проти молекул HLA, які також є на мембрані клітини-хазяїна. Хибно-негативні ( false negative ) результати можуть бути отримані, якщо сироватки пацієнтів були в стадії сероконверсії – зазору [ віконця ( window ) ] у часі між інфікуванням і накопиченням специфічних антитіл до вірусу.

82

Слайд 82

ELISA Activity An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA) is the first and most basic test to determine if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed. Plate ELISA

83

Слайд 83

The ELISA Method Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

84

Слайд 84: Positive ELISA Test

Negative ELISA Test

85

Слайд 85

Positive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical density at 450 nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis ELISA Activity ELISA data from three patients

86

Слайд 86: Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2

87

Слайд 87: Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- С ell Death Detection ELISA PLUS Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA

88

Слайд 88: Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

89

Слайд 89: Метод імунофлуоресценції

90

Слайд 90: Проточний цитофлуориметр (клітинний сортер)

91

Слайд 91: Проточна цитометрія

92

Слайд 92: Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

Анексин V ФІТЦ (-) / пропідій йодид (-), % Анексин V ФІТЦ (+) / пропідій йодид (-), % Анексин V ФІТЦ (+) / пропідій йодид (+), % Мертві клітини, % Контроль (А) 92,66 4,31 2,89 0,14 30 хв після опромінення (Б) 91,43 5,72 2,69 0,17 3 год після опромінення (В) 83,17 13,97 2,67 0,19

93

Слайд 93

Рис. Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів тимусу ( А ) та селезінки (Б) щурів за дії іонізуючої радіації: 1 - контроль; 2 - 1,0 Гр (30 хв після опромінення); 3 – 1,0 Гр (3 год після опромінення); 4 – 7,78 Гр (30 хв після опромінення); 5 – 7,78 Гр (3 год після опромінення) *- достовірно у відношенні до контролю, Р  0,05 А Б * * * * * * * Апоптотичні клітини, % Апоптотичні клітини, %

94

Слайд 94: ІМУНОБЛОТИНГ ( Western blotting )

95

Слайд 95

96

Слайд 96: Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

97

Слайд 97: Використання хемілюмінесцентних підходів в імуноблот -аналізі

Можливі 2 варіанти при аналізі по прямій схемі перексид водню окислює люмінол (+ пероксидаза); по непрямій схемі- антиген мітиться хемілюмінесціюючою групою (люмінолом чи його похідними). Така мітка у вільному стані окислюється з виділенням світла. У разі утворення комплексу з антитілом, вона втрачає можливість окислюватись, отже світіння буде відсутнє. В цьому випадку інтенсивність сигналу пропорційна тій кількості мітки, якій антиген не дав зв’язатись з антитілом. Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL - метод ( Enhanced Chemiluminescence ). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню, що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

98

Слайд 98: Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals

99

Слайд 99: Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject

100

Слайд 100: Будова вірусу імунодефіциту людини

101

Слайд 101

Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ, 1991) рекомендует следующую оценку результатов исследований, проведенных методом ИБ : Положительный результат — обнаружение в сыворотке антител к двум вирусным белкам из группы env ( gp41 -TM, transmembrane; gp120 - SU, surface; gp 160 ; gp 36 ) с наличием или отсутствием белков — продуктов других структурных генов gag, pol ( p24 - CA, capsid ;  р31- І nt, integrase). Отрицательный результат — отсутствие антитела к вирусоспецифическим белкам; Неопределенный результат — обнаружение в сыворотке антител к белкам из групп gag или pol.

102

Слайд 102

Band pattern Interpretation Lane 1, HIV+ serum (positive control) Lane 2, HIV- serum (negative control) Lane A, Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C No bands present Negative Bands at either p31 or p24 and bands present at either gp160 or gp120 Positive Bands present, but pattern does not meet criteria for positivity Indeterminate

103

Слайд 103

104

Слайд 104

105

Слайд 105: Метод ELISPOT а) методичний підхід,б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів

106

Слайд 106: Метод ELISPOT

The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN- γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots.

107

Последний слайд презентации

Похожие презентации

Ничего не найдено