Презентация: Виділення і застосування ДНК

Виділення і застосування ДНК Виділення і застосування ДНК Гріффітс Херші та Чейз План Виділення і застосування ДНК Виділення тотальної бактерійної ДНК Лізис Виділення тотальної бактерійної ДНК Виділення тотальної бактерійної ДНК Виділення плазмідної ДНК Виділення ДНК з крові Виділення ДНК з клітин Drosophila Виділення ДНК з клітин рослин Виділення і застосування ДНК Виділення і застосування ДНК Виділення і застосування ДНК Застосування виділеної ДНК Фінгерпринти Дякую за увагу
1/20
Средняя оценка: 4.0/5 (всего оценок: 78)
Скачать (3474 Кб)
Код скопирован в буфер обмена
1

Первый слайд презентации: Виділення і застосування ДНК

2

Слайд 2

Фрідріх Іоган Мішер

3

Слайд 3: Гріффітс

4

Слайд 4: Херші та Чейз

5

Слайд 5: План

Загальні етапи виділення ДНК. Виділення сумарної ДНК з клітин бактерій. Виділення плазмідної ДНК з клітин бактерій. Виділення ДНК з еукаріотичних клітин. Застосування виділених молекул ДНК.

6

Слайд 6

Сучасна концепція виділення ДНК ПІДГОТОВКА ЗРАЗКА ЛІЗИС КЛІТИН ІЗОЛЮВАННЯ ДНК Кров, кістковий мозок: градієнтне центрифугування з Ficoll ; інкубування в гіпотонічному розчині. Тканини: - гомогенізація в рідкому азоті чи без нього. Парафінізовані зразки: - регенерація ксиленом або інш. Гриби, бактерії, рослини: - використання геліказ, лізоциму, зимолази. використовуються набори детергентів : SDS, NaOH ; TrisHCl, EDTA; TritonX, TrisHCl, EDTA. Органічний метод. Неорганічний метод. Із використанням твердого носія __________ Мітохондрії: - гомогенізація клітин в льоді, 700-2600 g _- > супернатант - > 10000-16000 g->M.

7

Слайд 7: Виділення тотальної бактерійної ДНК

Етапи: I) Лізис Механічний у гомогенізаторі; За допомогою ультразвукового дезінтегратора; Використання літичних ферментів (лізоцим); Заморожуванням, розмерзанням; Використання детергентів – додецилсульфат натрію.

8

Слайд 8: Лізис

9

Слайд 9: Виділення тотальної бактерійної ДНК

II ) Депротеїнізація Використання детергентів, а саме промивання розчину в: -фенолі -суміші фенолу та ізоамілового спирту -суміші фенолу, ізоамілового спирту та хлороформу 2. Висолювання за участю ДСН і високої концентрації солі (ацетат калію) 3. Протеїназа К

10

Слайд 10: Виділення тотальної бактерійної ДНК

III ) Для екстракції ДНК з водного розчину використовують ізопропанол або подвійний об’єм етилового спирту. Етиловий спирт забирає гідратну шубу з молекул ДНК і вона випадає в осад. IV ) Промивання 70 % етанолом для очищення від солей V ) Осушення ДНК після промивання спиртом VI ) Розчинення в дистильованій воді або ТЕ-буфері. До складу ТЕ-буферу входить Tris - HCl для стабілізації рН і ЕДТА для інгібування залишкових білків VII ) Перевірка факту наявності ДНК.

11

Слайд 11: Виділення плазмідної ДНК

Лізис. Для створення лужного середовища використовують суміш ДСН і NaOH ; Ренатурація. Відновлення вихідного рівня рН здійснюється за допомогою оцтової кислоти, при цьому відбувається ренатурація плазмідної ДНК; Висолювання білків (додавання ацетату калію і ДСН призводить до осадження ДСН-білкових комплексів) або застосування суміші фенолу і хлороформу; Екстракція ДНК ізопропанолом; Промивання 70 % етанолом; Осушення ДНК після промивання спиртом; Розчинення у бідистильовані воді або ТЕ-буфері; Перевірка факту наявності ДНК; Зберігання. Виділену ДНК можна зберігати при +4°С або при -20°С.

12

Слайд 12: Виділення ДНК з крові

Відбір матеріалу; Обробка 0,5 М розчином ЕДТА; Зразок змішують з буфером, що містить: - сахарозу - тритон Х-100 (здетен лізувати цитоплазматичну мембрану, але не ядерну) - Tris - HCl ( для підтримування необхідного рівня рН ) - вода; Центрифугування. В осаді залишаються ядра, високомолекулярні сполуки залишаються у розчині. Промивання у гіпотонічному розчині. Депротеїнізація. ДНК осаджують ізопропанолом Промивання 70 % спиртом Осушення ДНК розчиняють у воді

13

Слайд 13: Виділення ДНК з клітин Drosophila

Відбір матеріалу; Тканину розтирають до гомогенного стану; Додають буфер до складу, якого входять: Tris-HCl ЕДТА Н20 ДСН Диетилпірокарбонат (ДЕПК) – реагує з гідроксиаміно та тіогрупами у білках і зв’язуючись з ними призводить до денатурації білків. Найвищою сорідненістю володіє до РНКаз; Депротеїнізація: - протеїназа К - суміш фенолу та ізоамілового спирту; Осадження ізопропанолом; Промивання 70 % спиртом; Осушення; Розчинення.

14

Слайд 14: Виділення ДНК з клітин рослин

Виділення тканини; Розтирання у ступці з рідким азотом до отримання гомогенної зеленої пудри; Гомогенат переносять до буферу наступного складу: Tris-HCl ЕДТА Аскорбінова кислота Диетилдитіокарбонат (поєднання аскорбінової кислоти з диетилдитіокарбонатом призводить до руйнування пігментів) NaCl Меркаптоетанол (меркаптоетанол руйнує дисульфідні зв’язки в білкових молекулах) Протеїназа К; Інкубація на водяній бані при температурі 65°С; Осаджують 2 рази білки. Спочатку хлороформом, а потім сумішшю фенолу та ізоамілового спирту; Осадження ДНК ізопропанолом; Промивання зразка; Осушування зразка; Зразок розчиняють в ТЕ-буфері; Очищення зразку ДНК від РНК. Застосовують РНКазу, 100 мкг/мл руйнує усі фракції РНК; Очищення від РНКази: – хлороформом - сумішшю фенолу та ізоамілового спирту.

15

Слайд 15

Неорганічний метод.

16

Слайд 16

Органічний метод.

17

Слайд 17

Із використанням твердого носія

18

Слайд 18: Застосування виділеної ДНК

Секвенування ДНК. Розділення ДНК в горизонтальному гель-електрофорезі. Картування ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції. Фінгерпринти. ПЛР. Гібридизація ДНК. Генно-інженерні маніпуляції. Перенесення виділеної ДНК у клітини-реципієнти і дослідження її функцій. Аналіз людської ДНК на наявність мутацій, що обумовлюють захворювання людини.

19

Слайд 19: Фінгерпринти

20

Последний слайд презентации: Дякую за увагу

Похожие презентации

Ничего не найдено