Презентация на тему: Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК

Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Секвенирование
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Свойства и состав ДНК
Это уже почти история…
Это уже почти история…
Секвенирование ДНК методом химической деградации 1976 г. Уолтер Гилберт и Алан Максам
Модификация нуклеотидов
Детекция и анализ продуктов химической деградации
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Секвенирование ДНК по Сэнгеру : " плюс - минус " метод
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Секвенирование ДНК по Сэнгеру : метод « терминаторов»
Секвенирование ДНК по Сэнгеру : метод « терминаторов»
Флуоресцентные красители
Меченые трифосфаты
Автоматическое секвенирование
Секвенирование на основе капиллярного электрофореза
Детекция и анализ
Приборная база
Секвенатор ABI Prism 3100
Секвенатор ABI Prism 3730 XL
Факторы, влияющие на качество секвенирования
Концентрация образца
Sequence Scanner V1.0
Sequence Scanner V1.0
Мало!!!
Мало!!!
Мало!!!
Много!!!
Много!!!
Много!!!
Много!!!
Много!!!
С генома
Недоочистка
Недоочистка
Недоочистка
Праймеры!!!
Особенности прибора (3730)
Особенности прибора (3100)
Геномное секвенирование
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Пиросеквенирование
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Принцип секвенирования
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Advantages of 2 base pair encoding
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК
1/86
Средняя оценка: 4.0/5 (всего оценок: 56)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (9993 Кб)
1

Первый слайд презентации

Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК

Изображение слайда
2

Слайд 2: Секвенирование

Sequence – последовательность Sequencing – секвенирование, считывание этой последовательности Манипуляция с молекулой нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК) – деградация, синтез, гибридизация Анализ буквенное представление нуклеотидной последовательности Детекция и сепарация продуктов реакции секвенирования Электрофорез, ФЭУ, масс-спектрометрия

Изображение слайда
3

Слайд 3

Секвенирование по Максаму-Гилберту ( метод химической деградации ) Секвенирование по Сенгеру ( метод ферментативного построения ) Методы высокопроизводительного геномного севенирования: Пиросеквенирование. Технология 454 Life Science «Мостиковая ПЦР». Технология Solexa Секвенирование лигированием. Технология SOLID TM System, Applied Biosystems "Секвенирование единичной молекулы" (single molecule sequencing) Разработки Helicos Biosciences Секвенирование "через нанопоры"

Изображение слайда
4

Слайд 4: Свойства и состав ДНК

Способность к термической или химической (ОН - ) обратимой денатурации Гидролиз по –Р-О-СН2- с образованием мономеров (Н + ) правило Чаргаффа (1951 год) G = С, А = Т A A C G G C T T T T G G C A A T

Изображение слайда
5

Слайд 5: Это уже почти история…

A.M. Maxam, W. Gilbert, 1977 определение нуклеотидной последовательности ДНК методом химической деградации F. Sanger, 1977 определение нуклеотидной последовательности ДНК методом ферментативного построения

Изображение слайда
6

Слайд 6: Это уже почти история…

A.M. Maxam, W. Gilbert, 1977 определение нуклеотидной последовательности ДНК методом химической деградации F. Sanger, 1977 определение нуклеотидной последовательности ДНК методом ферментативного построения P. Nyren и A. Lundin 1985 – 1987 метод анализа ДНК-полимеразной активности, основанный на определении пирофосфата

Изображение слайда
7

Слайд 7: Секвенирование ДНК методом химической деградации 1976 г. Уолтер Гилберт и Алан Максам

2. Модификация отдельных нуклеотидов под действием различных химических агентов (для каждого типа нуклеотидов или их комбинации – свои реакции модификации) 1. Получение фрагмента ДНК, меченого по одному концу радиоактивной меткой ( 3 2 P, 35 S) 3. Разрыв цепи Удаление модифицированных оснований -элиминация обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу 4. Разделение продуктов реакции в ПААГ высокого разрешения 5. Радиоавтография геля

Изображение слайда
8

Слайд 8: Модификация нуклеотидов

Пурины - метилирование (СН 2 ) диметилсульфатом А дениновых остатков по азоту в положении 3, а Г уаниновых - по азоту в положении 7. Последовательное выщепление HCl ( А ) и пиперидином ( А + Г ) Пиримидины – модификация гидразином ( Т + С ) или гидразином + NaCl ( T ). Выщепление пиперидином Секвенирование ДНК методом химической деградации

Изображение слайда
9

Слайд 9: Детекция и анализ продуктов химической деградации

Электрофорез в ПААГ G G + A T + C C Секвенирование ДНК методом химической деградации

Изображение слайда
10

Слайд 10

Преимущества Возможность анализа «сложных» участков ДНК с сильной вторичной структурой Анализируется исходная последовательность ДНК, а не ее вновь синтезированная копия  меньшая вероятность ошибки Не требуется ничего знать об исходной последовательности ( не нужны праймеры) Нет ферментативных реакций Недостатки относительно низкая производительность высокотоксичные реагенты Применим только для одноцепочечных молекул ДНК длиной не более 150 н.о. Практическое использование – контроль качества химического синтеза олигонуклеотидов Секвенирование ДНК методом химической деградации

Изображение слайда
11

Слайд 11: Секвенирование ДНК по Сэнгеру : " плюс - минус " метод

одноцепочечный фрагмент ДНК ДНК полимераза I из E.coli a- P 32 AT Ф Детекция – электрофорез в денатурирующем ПААГ Секвенирование ДНК по Сэнгеру : " плюс - минус " метод 1975 г. Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон

Изображение слайда
12

Слайд 12

Секвенирование ДНК по Сэнгеру : метод « терминаторов» 1977 г. Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон Модификация метода прямого ферментативного секвенирования ДНК (плюс-минус метод), с использованием в реакции дидезоксинуклеозидтрифосфатов (терминаторы)

Изображение слайда
13

Слайд 13: Секвенирование ДНК по Сэнгеру : метод « терминаторов»

Длина - около 300 н.о. CG A ATGCTCAGGCCATCA 3' 5' 5' Primer ssDNA разделение фрагментов с помощью капиллярного гель-электрофореза dATP, dTTP, dGTP, dCTP ddATP ddTTP ddGTP ddGTP

Изображение слайда
14

Слайд 14: Секвенирование ДНК по Сэнгеру : метод « терминаторов»

A T C G

Изображение слайда
15

Слайд 15: Флуоресцентные красители

Acridine 2-(N-акридинил-4-аминобутил)-1,3-пропандиол Pyrene 1-пирен-бутановая кислота Dansyl 6-(5-диметилфминонафталин-1-сульфонил)аминопропанол FAM 5(6)-карбоксифлуоресцеин R110 5(6)-карбоксиродамин 110 JOE 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин R6G 5(6)-карбоксиродамин R6G TAMRA 5(6)-карбокситетраметилродамин ROX 5(6)-карбокси-Х-родамин Dabsyl 4-((4-(диметиламино)-фенил)азо)-бензолсульфоновая кислота

Изображение слайда
16

Слайд 16: Меченые трифосфаты

Изображение слайда
17

Слайд 17: Автоматическое секвенирование

Современные секвенаторы капилляры гелевые пластины Считывание сигнала Однокрасочные Четырехкрасочные

Изображение слайда
18

Слайд 18: Секвенирование на основе капиллярного электрофореза

Изображение слайда
19

Слайд 19: Детекция и анализ

Изображение слайда
20

Слайд 20: Приборная база

ABI PRISM® 3730 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

Изображение слайда
21

Слайд 21: Секвенатор ABI Prism 3100

16 капилляров длиной 50 см в сборке. Средняя длина чтения – 650 п.н. Время рабочего цикла – 2,5 часа. Аргоновый лазер с длинами волн 488 и 514 нм для возбуждения флюоресценции. Работает в 96- и 384-луночном форматах. Автономен, не требует постоянного присутствия оператора. Электрокинетический ввод образцов. Ввод полимера в капилляры шприцевым насосом

Изображение слайда
22

Слайд 22: Секвенатор ABI Prism 3730 XL

96 капилляров длиной 50 см в сборке. Средняя длина чтения – 850 п.н. Время рабочего цикла – 2,0 часа. Аргоновый лазер с длинами волн 488 и 514 нм для возбуждения флюоресценции. Работает в 96- и 384-луночном форматах. Автономен, не требует постоянного присутствия оператора. Электрокинетический ввод образцов. Ввод полимера в капилляры автономной насосной системой

Изображение слайда
23

Слайд 23: Факторы, влияющие на качество секвенирования

Концентрация образца Тип образца Очистка образца Приборные особенности

Изображение слайда
24

Слайд 24: Концентрация образца

100-200 пар 1-3 нг 200-500 пар 3-10 нг 500-1000 пар 5-20 нг 1000-2000 пар 10-40 нг Свыше 2000 пар 40-100 нг Плазмиды 200-500 нг Космиды, ВАС, геномы 1 мкг

Изображение слайда
25

Слайд 25: Sequence Scanner V1.0

Изображение слайда
26

Слайд 26: Sequence Scanner V1.0

Изображение слайда
27

Слайд 27: Мало!!!

Изображение слайда
28

Слайд 28: Мало!!!

Изображение слайда
29

Слайд 29: Мало!!!

Изображение слайда
30

Слайд 30: Много!!!

Изображение слайда
31

Слайд 31: Много!!!

Изображение слайда
32

Слайд 32: Много!!!

Изображение слайда
33

Слайд 33: Много!!!

Изображение слайда
34

Слайд 34: Много!!!

Изображение слайда
35

Слайд 35: С генома

Изображение слайда
36

Слайд 36: Недоочистка

SAP, Exonuclease I Очистка через гель

Изображение слайда
37

Слайд 37: Недоочистка

Изображение слайда
38

Слайд 38: Недоочистка

Изображение слайда
39

Слайд 39: Праймеры!!!

Изображение слайда
40

Слайд 40: Особенности прибора (3730)

Изображение слайда
41

Слайд 41: Особенности прибора (3100)

Изображение слайда
42

Слайд 42: Геномное секвенирование

Изображение слайда
43

Слайд 43

Геномное секвенирование разрезание исследуемой молекулы ДНК на фрагменты (создание библиотеки) клонирование фрагментов ДНК в E. сoli получение образца ДНК последовательное секвенирование каждого фрагмента методом Сэнгера

Изображение слайда
44

Слайд 44

1990 – 2001 (2003) гг. Проект "Геном человека" (США) Расшифровано  3 млрд. нуклеотидных пар Средняя стоимость проекта – 3 млрд. US -долларов (1 доллар / нп) В начале проекта цена прочтения одного основания – 10 долларов. В конце проекта – 5 центов. 2003 г. J. Craig Venter Science Foundation объявил конкурс: приз в 0.5 млн. USD тому, кто снизит общую стоимость секвенирования генома человека (или генома похожей сложности) до 1000 долларов 2006 г. X Prize Foundation объявил розыгрыш приза в 10 млн.$ за секвенирование геномов. Условие - 100 человеческих геномов за 10 дней, по цене не более 10 000 $ за геном «…говорят, что скоро в программе Олимпийских игр появится новый вид спорта — геномное секвенирование…»

Изображение слайда
45

Слайд 45

Современные высокопроизводительные технологии секвенирования Манипуляция с молекулой нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК) – Анализ буквенное представление нуклеотидной последовательности Детекция и сепарация продуктов реакции секвенирования

Изображение слайда
46

Слайд 46

Высокопроизводительное параллельное секвенирование популяций клонально амплифицированных молекул ДНК "Секвенирование единичных молекул" ( S ingle M olecule S equencing) Современные технологии секвенирования

Изображение слайда
47

Слайд 47

Genome Sequencer 20 System, Genome Sequencer FLX System ( 454 Life Science ) DNA sequencing by ligation ( SOLID TM System, Applied Biosystems) Illumina Ge nome Analyzer по технологии Solexa SOLiD™ Analyzer Genome Analyzer Genome Sequencer FLX Высокопроизводительное параллельное секвенирование популяций клонально амплифицированных молекул ДНК

Изображение слайда
48

Слайд 48

Геномное секвенирование клонирование фрагментов ДНК в E. сoli амплификация каждого фрагмента последовательное секвенирование каждого фрагмента методом Сэнгера создание библиотеки ДНК - фрагментов

Изображение слайда
49

Слайд 49

создание библиотеки ДНК - фрагментов клонирование фрагментов ДНК в E. сoli амплификация каждого фрагмента последовательное секвенирование каждого фрагмента методом Сэнгера создание (с помощью ПЦР) молекулярных колоний, позволяющих обойтись без клонирования ДНК в бактериальных клетках одновременное секвенирование множества форагментов ДНК Геномное секвенирование – новые подходы

Изображение слайда
50

Слайд 50

Геномное секвенирование – новые подходы Создание библиотеки фрагментов ДНК Получение молекулярных колоний на основе единичных фрагментов ДНК Собственно прочтение нуклеотидной последовательности

Изображение слайда
51

Слайд 51

250 пн 250 пн 1000 - 10000 пн 2 Библиотека парных фрагментов 3 1 Фрагментная библиотека 2 1 Прочтение парных фрагментов Mate-Paired sequencing Двустороннее прочтение Paired-end sequencing Фрагментное прочтение Fragment sequencing Создание библиотеки фрагментов ДНК

Изображение слайда
52

Слайд 52

Фрагменты ДНК заданного диапазона длин Образец ДНК ДНК-фрагмент Adapter Adapter + Создание библиотеки фрагментов ДНК 250 пн Внешние адапторы

Изображение слайда
53

Слайд 53

отдельные молекулярные колонии (миллионы копий одной молекулы или фрагмента ДНК) создаются с помощью ПЦР с использованием физического носителя каждая такая колония не превышает в диаметре одного микрона - в качестве физического носителя используют магнитные бусины, заключенные в водных каплях водно-масляной эмульсии, либо иммобилизируют колонию непосредственно на предметном стекле микроскопа или на пластинке геля Молекулярные колонии = Полимеразные колонии = PCR-colony = polony – пространственно кластеризованные идентичные ампликоны (миллионы копий одной молекулы или фрагмента ДНК) Термин введен R. Mitra и G. Church в 1999- 2005 гг.

Изображение слайда
54

Слайд 54

до 10 10 независимых "химических реакторов"- водных капель – на 1 мл эмульсии вода масло стабилизаторы D = 1 ÷ 10 мкм ЭМУЛЬСИЯ – дисперсная (гетерогенная) система с жидкой дисперсионной средой и жидкой (реже газовой) дисперсной фазой. Прямая эмульсия - дисперсионная среда (обычно вода) более полярна, чем дисперсная фаза Обратная эмульсия - дисперсионная среда менее полярна, чем дисперсная фаза. Множественная эмульсия: капли дисперсной фазы содержат в своем объеме более мелкие капли дисперсионной среды. Простая обратная эмульсия – «вода в масле»: Клональная амплификация в эмульсии

Изображение слайда
55

Слайд 55

D≈1 μ m V ≈ 1 femtolitre D≈100 μ m V ≈ 1 nanolitre высокая емкость (>10 10 водных капель в 1 ml эмульсии) легкость образования высокая стабильность в широком диапазоне температур, рН, солевых концентраций уменьшение объема каждой реакции в 10 4 ÷ 10 10 раз по сравнению с минимально доступными объемами в традиционных методиках (реакционный объем 10 μ L в 1536-луночном микротитровальном планшете) FAM ( 40 pmol/ μ l ) Эмульсия под микроскопом (флуоресцентный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Eclipse E800 (Nikon) Клональная амплификация в эмульсии

Изображение слайда
56

Слайд 56

Клональная амплификация в эмульсии Бусина с ДНК-адапторами Бусина, обогащенная фрагментами ДНК

Изображение слайда
57

Слайд 57

Клональная амплификация в эмульсии Эмульсия до амплификации Эмульсия после амплификации

Изображение слайда
58

Слайд 58

Клональная амплификация в эмульсии Эмульсия до амплификации Эмульсия после амплификации

Изображение слайда
59

Слайд 59

Клональная амплификация в эмульсии Эмульсия до амплификации Эмульсия после амплификации

Изображение слайда
60

Слайд 60

Клональная амплификация в эмульсии Поликлональная бусина Моноклональная бусина Бусина с ДНК-адапторами

Изображение слайда
61

Слайд 61

1. Геномная ДНК фрагментируется, два адаптера лигируются на концы фрагментов 3. Полимеразная достройка по комплементарной цепи 2. Одноцепочечная ДНК иммобилизуется на оптически прозрачной поверхности вместе с праймерами, комплементарными адаптерам Клональная амплификация на твердой подложке

Изображение слайда
62

Слайд 62

5. Последующие циклы амплификации генерируют кластер клонов темплатной молекулы ДНК 4. После первого цикла амплификации двухцепочечная ДНК денатурируется Клональная амплификация на твердой подложке 10 млн. кластеров на см 2

Изображение слайда
63

Слайд 63

454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY Margulies et al, 2005; Leamon, 200 3 ; Dressman, 2003 и др. Genome Sequencer 20 System Roche (454) Genome Sequencer FLX System Ключевой момент - пиросеквенирование 454 Life Science Corp., Roche Diagnostics 1 Клональная амплификация- эмульсионная ПЦР Создание библиотеки - стандартно 2 3

Изображение слайда
64

Слайд 64

2. Эмульсионная ПЦР : фрагменты ДНК пришиваются к магнитным шарикам таким образом, чтобы на каждый шарик приходился только один фрагмент, и амплифицируются в эмульсионной ПЦР. Каждый шарик в конце ПЦР несет 10 млн. копий уникального фрагмента ДНК Создание библиотеки : геномная ДНК фрагментируется на 300-500 bp -фрагменты, лигируется к адаптерам и денатурируется 454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY Технология 454 Life Science

Изображение слайда
65

Слайд 65

3. Иммобилизация на твердой поверхности : эмульсия разбивается, шарики, несущие клоны одноцепочечной ДНК, распределяются в лунки специально разработанного оптоволоконного чипа PicoTiterPlate TM [Leamon, 2003] Один шарик – одна лунка! 4. Пиросеквенирование: необходимые реагенты, иммобилизованные на шариках меньшего размера, поступают в каждую лунку 454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY

Изображение слайда
66

Слайд 66

PicoTiterPlate TM 454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY 1.6 млн. отдельных PCR реакций в объеме 75 pL - это срез блока, полученного путём вытягивания и сплавления оптических волокон Каждое волокно имеет сердечник, который затем вытравливается, образуя лунки ≈ 55 мкм глубиной, диаметром 44 мкм, с расстоянием ≈ 50 мкм между центрами соседних лунок Объём лунки — 75 пиколитров Плотность размещения лунок на поверхности слайда — 480 лунок на квадратный миллиметр Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок, в каждую из которых попадает одна бусинка с ДНК-матрицей Лунки достаточно глубоки, чтобы бусинки, несущие ДНК-матрицу, не выскакивали из них под действием конвекции Лунки достаточно мелкие для осуществления быстрой диффузии нуклеотидов в лунку и быстрого вымывания оставшихся нуклеотидов и продуктов реакции в конце каждого цикла

Изображение слайда
67

Слайд 67: Пиросеквенирование

ДНК ФЭУ или цифровая камера 454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК, при этом высвобождается молекулы пирофосфата под действием фермента АТФ-сульфурилазы, в присутствии аденозин - фосфо - сульфата, пирофосфат превращается в АТФ АТФ запускает реакцию окисления специально добавленного вещества - люциферина - ферментом люциферазой этот процесс сопровождается хемилюминесценцией хемилюминесценция регистрируется CCD -камерой фермент апираза дезактивирует нуклеотиды, которые не встроились в растущую цепь ДНК

Изображение слайда
68

Слайд 68

Один цикл секвенирования ( run, "прогон" ) – примерно 5 ч. Один цикл - 200,000 ÷ 350,000 реакций, а теперь уже 1.6 млн. реакций! В каждой реакции изначально прочитывалось около 100 оснований, потом 250, а теперь уже около 400 В 2005 году по технологии Life Sciences за один раз (!!!) был расшифрован 600 000 -нуклеотидный геном бактерии Mycoplasma genitalium с точностью 99,4%. Весь процесс занял примерно одни сутки 454 SEQUENCING TM TECHNOLOGY

Изображение слайда
69

Слайд 69

SOLEXA CLONAL SINGLE MOLECULE ARRAY Bennett, 2004; Adessi et al., 2000 Illumina Ge nome Analyzer по технологии Solexa Genome Analyzer Ключевой момент – "мостиковая ПЦР" ( bridge PCR) на поверхности стекла Секвенирование – по методу Сэнгера 1 Создание библиотеки - стандартно 2 3

Изображение слайда
70

Слайд 70

Illumina

Изображение слайда
71

Слайд 71

6. Секвенирование с помощью флуоресцентно меченых обратимо терминирующих нуклеотидов SOLEXA CLONAL SINGLE MOLECULE ARRAY

Изображение слайда
72

Слайд 72

чип Прибор для формирования кластеров на чипе Прибор для получения парной библиотеки

Изображение слайда
73

Слайд 73

Группа George M. Church (Shendure, Mitra et al., 2005) SOLID TM System, Applied Biosystems SOLiD™ Analyzer Ключевой момент – « сиквенс посредством лигирования » 1 Создание библиотеки - стандартно 2 3 Клональная амплификация- эмульсионная ПЦР

Изображение слайда
74

Слайд 74

4х-цветное перекрывание АВ SOLiD Детекция результатов Модификация 3´-конца и нанесение бусин на стекло

Изображение слайда
75

Слайд 75

Флуоресцентные зонды Зонды являются октамерами где n - “ вырожденные ” основания z – “ универсальные ” основания Флуоресцентная краска соответствует основанию в 5м положении Расщепление происходит между 5м и 6м основаниями Место расщепления пространственно _ _ отделено от места лигирования и красителя

Изображение слайда
76

Слайд 76: Принцип секвенирования

Обогащенные бусины на поверхности стекла инкубируются с универсальным праймером, комплементарным прямому адаптору Универсальный сиквенсовый праймер Универсальный сиквенсовый праймер Матричная ДНК Прямой адаптер

Изображение слайда
77

Слайд 77

Смесь из 4-х зондов, меченных различными флуорофорами и содержащих определяемый нуклеотид, конкурентно пришивается к праймеру с использованием ДНК-лигазы Принцип секвенирования POLONY SEQUENCING BY LIGATION Универсальный сиквенсовый праймер Универсальный сиквенсовый праймер зонд зонд зонд Лигаза Матричная ДНК Прямой адаптер Лигаза зонд

Изображение слайда
78

Слайд 78

Просмотр результата после лигирования Матричная ДНК Прямой адаптер Универсальный сиквенсовый праймер АВ SOLiD Детекция флуоресценции осуществляется под воздействием ксеноновой лампы, затем флуорофор удаляется

Изображение слайда
79

Слайд 79

Матричная ДНК Прямой адаптер Праймер n - 1 Праймер n - 2 Праймер n - 3 Праймер n - 4 Сиквенс. праймер Возврат Возврат Возврат Возврат Круги секвенирования с различными праймерами АВ SOLiD

Изображение слайда
80

Слайд 80

A C G T A C G T 2 nd Base 1 st Base Red -probe 5’ n n n A T z z z 3’ Blue -probe 5’ n n n T T z z z 3’ On our probes the 1 st base encoded is position 4 the 2 nd base encoded is position 5 АВ SOLiD

Изображение слайда
81

Слайд 81

Example of decoding AA CC GG TT AC CA GT TG AC CA GT TG AA CC GG TT AA CC GG TT AG CT GA TC AG CT GA TC AG CT GA TC AT CG GC TA AACAAGCCTC

Изображение слайда
82

Слайд 82

Summary AC CA GT TG AC CA GT TG AA CC GG TT AA CC GG TT AG CT GA TC AG CT GA TC AG CT GA TC AT CG GC TA For any combination of colors there is only one solution once a base is known. There are four potential solutions (one for each potential starting base) AA CC GG TT

Изображение слайда
83

Слайд 83: Advantages of 2 base pair encoding

Double base interrogation eases the discrimination between system errors and true polymorphism A C G G T C G T C G T G T G C G T A C G G T C G T C G T G T G C G T

Изображение слайда
84

Слайд 84

A C G G T C G T C G T G T G C G T Advantages of 2 base pair encoding Real SNP expected observed Two color changes represent only a single mismatch to reference sequence (SNP) A C G G T C G C C G T G T G C G T

Изображение слайда
85

Слайд 85

Высокопроизводительное параллельное секвенирование популяций клонально амплифицированных молекул ДНК "Секвенирование единичных молекул" ( S ingle M olecule S equencing) Современные технологии секвенирования

Изображение слайда
86

Последний слайд презентации: Современные методы анализа нуклеотидной последовательности ДНК

На сегодняшний день… Секвенирование и ресеквенирование геномов Метагеномика Способность секвенировать целый геном из одной некультивируемой клетки позволит нам выявить все чудовищное биоразнообразие

Изображение слайда