Презентация на тему: Серологические реакции

Серологические реакции
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Применение СР
Фазы СР
Параметры СР
Классификация серологических реакций
Реакции агглютинации и преципитации
Реакции агглютинации и преципитации
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (РА)
РА на стекле
Развернутая РА
Серологические реакции
Реакции непрямой агглютинации
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
Реакция обратной непрямой гемагглютинации ( РОНГА )
Латекс-агглютинация
Реакция коагглютинации
Реакция преципитации
Реакция кольцепреципитации
Реакция микропреципитации
Двойная диффузия в геле по Оухтерлони
Радиальная иммунодиффузия по Манчини
Иммуноэлектрофорез
Реакция нейтрализации токсина
Реакция нейтрализации токсина in vivo
Реакция нейтрализации токсина in vivo
Серологические реакции
Серологические реакции
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РНГА
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ
Реакции с участием комплемента
Реакция иммунного бактериолиза
Реакция иммунного гемолиза
Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция связывания комплемента (РСК)
РСК. Титрование комплемента
РСК. Основной опыт
Микрореакция связывания комплемента (МРСК)
Реакция радиального гемолиза (РРГ)
Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )
Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )
Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )
Иммуноферментный анализ (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)
Иммуноферментный анализ Прямой твердофазный ИФА
Иммуноферментный анализ Непрямой твердофазный ИФА
Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА
Иммуноферментный анализ Общая схема
Радиоиммунологический анализ
Иммуноблоттинг
1/51
Средняя оценка: 4.1/5 (всего оценок: 47)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (6760 Кб)
1

Первый слайд презентации

Серологические реакции

Изображение слайда
2

Слайд 2: ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Серологические реакции – это реакции взаимодействия между антигеном и соответствующим ему специфическим антителом in vitro, имеющие различные внешние проявления. Широко используются в микробиологических и серологических лабораториях с целью: серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний, сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов

Изображение слайда
3

Слайд 3: Применение СР

Для серологической диагностики: обнаружение неизвестных антител с помощью известного антигена – диагностикума обнаружение неизвестных антигенов с помощью известных антител. Для серологической идентификации возбудителя – определение серогруппы, серовара возбудителя с помощью специфической иммунной диагностической сыворотки

Изображение слайда
4

Слайд 4: Фазы СР

Специфическая (невидимая, быстрая, обратимая) – результат взаимодействия антигена и антитела за счет водородных, кулоновских и вандерваальсовых сил. Неспецифическая (видимая, медленная, необратимая) – появление видимых изменений: агглютинации, гемолиза и т.д.

Изображение слайда
5

Слайд 5: Параметры СР

Чувствительность реакции указывает на концентрацию антител или антигенов, которая определяется с помощью данной реакции. Специфичность - способность антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно.

Изображение слайда
6

Слайд 6: Классификация серологических реакций

Изображение слайда
7

Слайд 7: Реакции агглютинации и преципитации

Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы"). Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты. Согласно гипотизе Полинга антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.

Изображение слайда
8

Слайд 8: Реакции агглютинации и преципитации

При оптимальном соотношении антигена и антител образуются большие прочные комплексы, видимые простым глазом. При избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы. При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

Изображение слайда
9

Слайд 9: Реакция агглютинации

Метод обнаружения корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов) путем их склеивания антителами с образованием аггломератов – хлопьев, в присутствии электролита NaCl. РА используют для: Серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя Экспресс-обнаружения возбудителя обнаружения антител в сыворотке крови больного животного

Изображение слайда
10

Слайд 10: Реакция агглютинации (РА)

Компоненты реакции: Антиген – крупный, корпускулярный, целая клетка (бактерия или эритроцит) Антитело – IgM (валентность 5) Физраствор Агглютинация с О- диагностикумом   (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Агглютинация с Н - диагностикумом  (бактерии, убитые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее. Способы постановки : РА на стекле; развернутая РА

Изображение слайда
11

Слайд 11: РА на стекле

- используется в основном для серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя, реже для ускоренного обнаружения антител Постановка реакции: На предметное стекло помещают каплю сыворотки (Опыт) и каплю физраствора (Контроль) В каждой капле распределяют взвесь бактерий Появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации – положительный результат Равномерное помутнение – отрицательный результат Опыт «+» Контроль «-»

Изображение слайда
12

Слайд 12: Развернутая РА

- используется в основном для обнаружения антител в сыворотке больного Постановка реакции: Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин. При этом готовят десятикратные разведения исследуемой сыворотки и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок и сам раствор становится прозрачным, отрицательный   результат- помутнение раствора сохраняется «+» «-»

Изображение слайда
13

Слайд 13

Реакция агглютинации Реакция преципитации Механизм Теория решетки Марека- Полинга Антиген Крупный, корпускулярный, целая клетка Мелкодисперсный, растворимый Антитела IgM IgG

Изображение слайда
14

Слайд 14: Реакции непрямой агглютинации

- Метод обнаружения антигенов и антител, который основан на способности корпускулярных носителей( эритроцитов, шариков латекса, клеток стафилококков ) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены. - В зависимости от типа корпускулярного носителя различают: РНГА Латекс-агглютинация РКоА

Изображение слайда
15

Слайд 15: Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Компоненты реакции: 1. Эритроцитарный диагностикум ( эритроциты с адсорбированными на них антигенами) 2. Исследуемая сыворотка 3. Физраствор РНГА ставят в пластиковых планшетках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Титр сыворотки= 1:160 (максимальное разведение исследуемого материала, при котором реакция положительна)

Изображение слайда
16

Слайд 16: Реакция обратной непрямой гемагглютинации ( РОНГА )

Компоненты реакции: 1. Эритроцитарный антительный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на них антителами 2. Исследуемый материал 3. Физраствор Постановка РОНГА не отличается от РНГА Применение: обнаружение аг (например, бактериального экзотоксина)

Изображение слайда
17

Слайд 17: Латекс-агглютинация

Вариант РНА, в которой частицы латекса с адсорбированными на них молекулами антигенов или антител агглютинируются соответствующими антигенами или антителами. Применяют качественный и количественный методы. Ставят по типу агглютинации на стекле. антитело Латексные частицы, покрытые антигенами

Изображение слайда
18

Слайд 18: Реакция коагглютинации

Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка ( антительный диагностикум ). Антительный диагностикум Белок А имеет сродство к Fc -фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция коагглютинации

Изображение слайда
19

Слайд 19: Реакция преципитации

Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Компоненты реакции: Антиген – мелкодисперсный, растворимый Антитело – IgG (валентность 2 ) Физраствор Преципитат образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках ( реакция кольцепреципитации ), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

Изображение слайда
20

Слайд 20: Реакция кольцепреципитации

Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное  кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией- термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен ). Опыт Контроль

Изображение слайда
21

Слайд 21: Реакция микропреципитации

Изображение слайда
22

Слайд 22: Двойная диффузия в геле по Оухтерлони

Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.

Изображение слайда
23

Слайд 23: Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. Зависимость диаметра кольца преципитации от количества аг

Изображение слайда
24

Слайд 24: Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Принцип ИЭФ состоит в следующем: Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в забуференном геле агара ; после разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

Изображение слайда
25

Слайд 25: Реакция нейтрализации токсина

Тип иммунологической реакции, основанный на способности специфических антител – антитоксинов подавлять биологическую активность экзотоксинов бактерий при образовании комплекса аг-ат. РОНГА, РНАт

Изображение слайда
26

Слайд 26: Реакция нейтрализации токсина in vivo

Контрольная группа (Вводят исслед.материал Исслед.материал + ат против токсина А Исслед.материал + ат против токсина В Исслед.материал + ат против токсина Е

Изображение слайда
27

Слайд 27: Реакция нейтрализации токсина in vivo

Проба Шика проводится для оценки состояния антитоксического иммунитета; внутрикожно вводят минимальное количество токсина: При наличии антител против дифтерийного токсина видимых изменений не будет При отсутствии антитоксического имммунитета наблюдается воспалительная реакция Реакция нейтрализации токсина in vivo

Изображение слайда
28

Слайд 28

Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в определенныхсоотношениях с анти­токсической сывороткой образовывать помутнение- инициальную флоккуляцию Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации. Применяется для титрования антитоксических сывороток и определения типа токсина Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции — ( Lf ). Силу антитоксической сыворотки выражают в международных антитоксических единицах – МЕ Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции ), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей антитоксина. То есть, условие инициальной флоккуляции : nLF =n МЕ Реакция нейтрализации токсина in vitro Реакция флоккуляции В данном опыте помутнение – инициальная флоккуляция – происходит в пробирке №3 Каждая пробирка содержит 2х20=40 Lf токсина Поскольку условие инициальной флоккуляции : nLF =n МЕ, то в данной пробирке 40 МЕ сыворотки Если 0,4 мл сыворотки содержат 40МЕ, то 1мл- 100МЕ

Изображение слайда
29

Слайд 29

Штаммы возбудителя дифтерии — С. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox -ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре Главное преимущество – отсутствие необходимости выделения чистой культуры Реакция нейтрализации токсина in vitro Реакция преципитации в геле

Изображение слайда
30

Слайд 30: Реакция нейтрализации токсина in vitro. РНГА

Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина. Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка. Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка. Вывод : В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Изображение слайда
31

Слайд 31: Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ

РОНГА - применяют  антительный эритроцитарный диагностикум  - эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Антиген –дифтерийный токсин «+» «-»

Изображение слайда
32

Слайд 32: Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ

РНАТ позволяет быстро выявить неизвестный антиген. Компоненты реакции: Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против дифтерийного токсина) Исследуемая сыворотка ? Принцип метода Результаты: При отсутствии антигена в исследуемой сыворотке диагностикум взаимодействует со стандартной сывороткой и наблюдаем гемагглютинацию При наличии антигена в исследуемой сыворотке антитела в нашей диагностической сыворотке будут нейтрализованы и агглютинации эритроцитов не будет + ? ( ) + «-» «+»

Изображение слайда
33

Слайд 33: Реакции с участием комплемента

Сущность этих реакций состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс антиген-антитело, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток.

Изображение слайда
34

Слайд 34: Реакция иммунного бактериолиза

Нативная сыворотка обладает бактерицидной активностью, В иммунной сыворотке в присутствии специфических антител-бактериолизинов и комплемента лизис бактерий идет существенно интенсивнее Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются. Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса ).

Изображение слайда
35

Слайд 35: Реакция иммунного гемолиза

Как видно из результатов опыта, гемолиз происходит только в присутствии аг (эритроциты барана), соответствующих антител и комплемента В отсутствии одного из ингредиентов гемолиза не наблюдается

Изображение слайда
36

Слайд 36: Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. Первая система – специфическая : антиген, антитело (испытуемая сыворотка) и комплемент (сыворотка морских свинок) Вторая система – неспецифическая индикаторная – гемолитическая (эритроциты барана с гемолитической сывороткой, лишенной собственной активности комплемента).

Изображение слайда
37

Слайд 37: Реакция связывания комплемента (РСК)

PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), таким образом происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная) Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). - +

Изображение слайда
38

Слайд 38: РСК. Титрование комплемента

В приведенном примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10. Для приготовления гемолитической системы смешивают равные объемы гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора

Изображение слайда
39

Слайд 39: РСК. Основной опыт

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 К1 К2 К3 К4 Специфическая система: Антитела (сыворотка в различных разведениях). Антиген - диагностикум Комплемент по 0,5 мл Смешивают, инкубируют 60 минут при 37°С. Индикаторная система Добавляют по 2 мл гемолитической системы (ГС) Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С. Учитывают результаты реакции. К1 – контроль сыворотки (сыворотка + комплемент+ГС К2 – контроль антигена ( антиген+комплемент+ГС ) К3- контроль гемолитической системы (2мл ГС+физраствор ) К4 – контроль комплемента (2 мл ГС+ 0,5мл комплемента) В нашем примере результат положительный. Титр сыворотки 1:80

Изображение слайда
40

Слайд 40: Микрореакция связывания комплемента (МРСК)

Пример МРСК с парными сыворотками В сыворотке, взятой через 5 дней после первого исследования титр выше, что свидетельствует о развитии иммунного ответа на данный антиген Микрореакция ставится по тому же принципу, что и РСК, но с меньшими объемами в микроплатах

Изображение слайда
41

Слайд 41: Реакция радиального гемолиза (РРГ)

Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз

Изображение слайда
42

Слайд 42: Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса )  - качественный метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется  для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов ( иммунофенотипирование ) и др. клеток. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина ) вступать в химическую связь с сывороточными белками,  не    нарушая    их    иммунологической   специфичности.

Изображение слайда
43

Слайд 43: Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )

Различают   две разновидности метода: прямой, непрямой. Прямой метод РИФ  основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. АГС ( антиглобулиновая сыворотка) Пневмококки

Изображение слайда
44

Слайд 44: Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса )

Непрямой метод РИФ  заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают специфическими антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой ( антикроличьей ) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.. Treponema pallidum

Изображение слайда
45

Слайд 45: Иммуноферментный анализ (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)

Лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Метод основан на использовании антител с использованием фермента в качестве метки. С помощью ИФА определяют наличие антигенов возбудителей различных инфекций, но значительно чаще метод ИФА применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG  к антигенам различных возбудителей болезней.

Изображение слайда
46

Слайд 46: Иммуноферментный анализ Прямой твердофазный ИФА

Результат ИФА. Желтый цвет раствора в лунке является положительным результатом. Фотография микропланшета При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела ( конъюгат ) Связанный с антителом фермент обнаруживают по изменению цвета раствора после добавления субстрата (перекись водорода) и хромогена

Изображение слайда
47

Слайд 47: Иммуноферментный анализ Непрямой твердофазный ИФА

Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата ( антиглобулиновая сыворотка с ферментной меткой). В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах.

Изображение слайда
48

Слайд 48: Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых ( конъюгат ) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы Искомый антиген(1 ) и меченый ферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

Изображение слайда
49

Слайд 49: Иммуноферментный анализ Общая схема

Анализатор иммуноферментный полуавтоматический Иммуноферментный автоматический анализато

Изображение слайда
50

Слайд 50: Радиоиммунологический анализ

Принцип.  В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика  РИАпроста и включает следующие основные этапы: А.  К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе. Б.  Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе. В.  Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их отделяют от свободного меченного антигена. Иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка. Г.  Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Рис. 8. Радиоиммунологический анализ:1 - антиген; 2 - антитело; 3 - радиоактивная метка. Радиоиммунологический анализ : 1 - антиген; 2 – стандартныйантиген с радиоактивной меткой; 3 - антитело. РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В, у больных вирусным гепатитом. 1 2 3

Изображение слайда
51

Последний слайд презентации: Серологические реакции: Иммуноблоттинг

Антигены возбудителя разделяют с помощью  электрофореза  в полиакриламидном геле, затем переносят их ( блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью  ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с " блотами " антигенов. На эти полоски ( стрипы ) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента. Пример: Лайн-блот для диагностики TORCH- инфекций ( Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

Изображение слайда