Презентация на тему: ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Полимеразная цепная реакция
Изобретение ПЦР
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Состав реакционной смеси
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Технология « ПЦР-чип »
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Постгеномная Эра
Контроль качества ПЦР
Рекомендуемые параметры праймеров :
Рекомендуемые параметры праймеров :
Контроль качества выделенной РНК
Различия в коэффициетах α
Переменная и постоянная фоновая флюоресценция
Эффективность реакции
Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции
ПЦР «в реальном времени»
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Анализ количества мРНК гена ( qRT -PCR )
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
Что такое матрица?
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Немного истории
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
Применение MALDI
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
МАЛДИ масс-спектрометрия в медицине
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)
1/53
Средняя оценка: 4.3/5 (всего оценок: 92)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (7271 Кб)
1

Первый слайд презентации

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)

Изображение слайда
2

Слайд 2

Полимеразная цепная реакция Это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей

Изображение слайда
3

Слайд 3: Полимеразная цепная реакция

Метод ферментативной наработки in vitro определённых, сравнительно коротких (до нескольких тысяч пар нуклеотидов), двуцепочечных фрагментов ДНК. В основе реакции лежит механизм репликации молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой.

Изображение слайда
4

Слайд 4: Изобретение ПЦР

В 1983 г. химик компании Cetus, Кэри Маллис, оптимизируя метод олигомерной рестрикции для идентификации точечных мутаций в ДНК, придумал как многократно увеличить количество копий определённого участка ДНК. Kary Mullis, Лауреат Нобелевской премии 1993 г. по химии

Изображение слайда
5

Слайд 5

ПЦР проводят в амплификаторе  — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Амплификатор

Изображение слайда
6

Слайд 6

Для ПЦР необходимы: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза  — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксинуклеозидтрифосфаты ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ).

Изображение слайда
7

Слайд 7

ПЦР осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса: Денатурация Ренатурация Синтез

Изображение слайда
8

Слайд 8

Изображение слайда
9

Слайд 9

Денатурация Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 минут, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Изображение слайда
10

Слайд 10

Ренатурация (Отжиг) Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 минут. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Изображение слайда
11

Слайд 11

Синтез (Элонгация) ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.

Изображение слайда
12

Слайд 12: Состав реакционной смеси

Исследуемая ДНК ДНК-зависимая-ДНК-полимераза Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты ( dNTP ) ДНК-затравки ( праймеры ) Интеркалирующих краситель (обычно SYBR Green) или Флуоресцентно меченные ДНК-зонды Разрушение водородных связей между цепями ДНК (денатурация) 93-96 °С 40-75 °С Гибридизация праймеров на ДНК (отжиг праймеров ) 60-75 °С Синтез комплементарных цепей ДНК (элонгация) Буферный раствор с MgCl 2 93-96 °С «Горячий старт» - активация полимеразы, размешивание компонентов 5-15 секунд 1-10 минут 30 секунд 0-15 секунд

Изображение слайда
13

Слайд 13

Полимеразная цепная реакция с возможностью детекции продукта в реальном времени ( RT-PCR). Секвенирование по Сенгеру

Изображение слайда
14

Слайд 14

Изображение слайда
15

Слайд 15

Изображение слайда
16

Слайд 16

Изображение слайда
17

Слайд 17

Изображение слайда
18

Слайд 18

Изображение слайда
19

Слайд 19

Изображение слайда
20

Слайд 20

Изображение слайда
21

Слайд 21

Изображение слайда
22

Слайд 22

Изображение слайда
23

Слайд 23

Изображение слайда
24

Слайд 24

Изображение слайда
25

Слайд 25

Изображение слайда
26

Слайд 26: Технология « ПЦР-чип »

Анализ экспрессии 84 генов за один раз

Изображение слайда
27

Слайд 27

Изображение слайда
28

Слайд 28: Постгеномная Эра

26 июня 2000 года было объявлено о расшифровке генома человека. На данный момент известны геномы множества организмов. Геном человека, других организмов, последовательности отдельных генов находятся в свободном доступе в интернете. Коммерческий синтез олигонуклеотидов качественен, быстр и доступен по цене. Всё это предоставляет современным исследователям огромное, неизведанное поле для творчества, базовыми инструментами в котором являются ПЦР и секвенирование, в различных модификациях.

Изображение слайда
29

Слайд 29: Контроль качества ПЦР

Проверка соответствия праймеров рекомендуемым параметрам, при их дизайне; Подбор стабильного референсного гена; Контроль качества и количества выделенной нуклеиновой кислоты; Контроль эффективности обратной транскрипции; Контроль наличия геномной ДНК в РНК-пробе; Отрицательный контроль (загрязнение растворов); Контроль параметров E и α ; Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции; Калибровка инструмента, при необходимости нормализация по ROX.

Изображение слайда
30

Слайд 30: Рекомендуемые параметры праймеров :

Длина 18-22 осн. Температура плавления 52-60˚С Содержание GC: 40-60% Вторичные структуры : Шпильки : Δ G>-2 ккал / моль на 3 ’ -конце и Δ G>- 3 ккал / моль - внутренние Гомодимеры : Δ G>-5 ккал/моль Гетеродимеры : Δ G>-5 ккал/моль

Изображение слайда
31

Слайд 31: Рекомендуемые параметры праймеров :

Повторы : не более 4 динуклеотидных повтора Не более 4 одинаковых нуклеотидов подряд Повторы : Минимум G/C на 3' конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов) Отсутствие кросс- гомологичности к другим последовательностям в геноме объекта (проверяется в системе BLAST).

Изображение слайда
32

Слайд 32: Контроль качества выделенной РНК

Основной критерий – при элеткрофорезе должны быть чётко различимы 18 S и 28 S субъединицы рибосомальной РНК! 28 S 18S

Изображение слайда
33

Слайд 33: Различия в коэффициетах α

α – это коэфициент пропорциональности между накоплением молекул продукта реакции ( N) и увеличением флюоресцентного сигнала ( F) F= α N

Изображение слайда
34

Слайд 34: Переменная и постоянная фоновая флюоресценция

Изображение слайда
35

Слайд 35: Эффективность реакции

Изображение слайда
36

Слайд 36: Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции

Изображение слайда
37

Слайд 37: ПЦР «в реальном времени»

Циклы Флуоресценция Пороговый цикл (С t )

Изображение слайда
38

Слайд 38

Анализ содержания ГМО в продуктах питания; Установление отцовства; Криминалистика: «Генетические отпечатки пальцев»; В медицине: Диагностика наследственных заболеваний; Диагностика инфекционных заболеваний; Контроль эффективности лечения; Персонализированная медицина. Прикладное применение ПЦР

Изображение слайда
39

Слайд 39: Анализ количества мРНК гена ( qRT -PCR )

Изображение слайда
40

Слайд 40

Применение ПЦР: Криминалистика Установление отцовства Медицинская диагностика Клонирование генов мутагенез

Изображение слайда
41

Слайд 41

MALDI

Изображение слайда
42

Слайд 42: Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

МАЛДИ — (от англ. MALDI, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization ) — десорбционный метод «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом.

Изображение слайда
43

Слайд 43: Что такое матрица?

Матрица представляет собой материал, свойства которого обуславливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. МАЛДИ масс-спектрометрия находит своё широкое применение для анализа нелетучих высокомолекулярных соединений (пептиды, белки, углеводы, олигонуклеотиды и др.)

Изображение слайда
44

Слайд 44

Считается, что вещество, используемое в качестве матрицы, должно отвечать следующим основным требованиям: 1) обладать высоким коэффициентом экстинкции при длине волны лазерного излучения; 2) иметь способность к ионизации нейтральных молекул анализируемого вещества путём переноса заряда или заряженной частицы; 3) обладать хорошей растворимостью в растворителях, применяемых в процессе пробоподготовки ; 4) быть химически инертным по отношению к анализируемому веществу; 5) иметь низкую летучесть и термическую устойчивость.

Изображение слайда
45

Слайд 45

Изображение слайда
46

Слайд 46: Немного истории

Впервые возможность применения матрицы для подавления фрагментации при анализе нелетучих органических соединений на примере белков и пептидов была продемонстрирована в 1987 году группой ученых в Германии (M. Karas and F. Hillenkamp ). За открытие метода МАЛДИ японский инженер Коити Танака известной японской приборостроительной корпорации Shimadzu получил в 2002 году Нобелевскую премию. Коити Танака со своей женой

Изображение слайда
47

Слайд 47

Схематическое представление механизма МАЛДИ

Изображение слайда
48

Слайд 48

Изображение слайда
49

Слайд 49: Применение MALDI

Диапазон применения МАЛДИ достаточно широк и охватывает многие классы химических соединений: Биоорганические соединения (пептиды, белки, олигонуклеотиды, олигосахариды и т. п.); Синтетические полимеры; Органические комплексные соединения; Высокомолекулярные материалы; Синтетические дендримеры ; Фуллерены и др.

Изображение слайда
50

Слайд 50

Изображение слайда
51

Слайд 51: МАЛДИ масс-спектрометрия в медицине

С конца 2000-х технология MALDI-TOF начала применяться в практической медицине для быстрой идентификации видовой принадлежности. Идентификация микроорганизмов основывалась на получения общего масс-спектра белков в диапазоне 1000-10000 D а и биоинформационного сравнения полученного спектра с базой данных рефренсных спектров.

Изображение слайда
52

Слайд 52

Применение метода позволило значительно сократить затраты и время бактериологического анализа и увеличить его точность. Система получила широкое распространение в мире. На начало 2015 года в мире используется более 1500 систем MALDI Biotyper. В России установлено более 80 систем.

Изображение слайда
53

Последний слайд презентации: ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ( ПЦР)

Изображение слайда