Презентация на тему: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Способы культивирования вирусов
Использование для вирусологического метода куриного эмбриона
Основные способы заражения куриных эмбрионов
Обнаружение вирусов в курином эмбрионе
Использование культур клеток
Первичные культуры клеток
Перевиваемые культуры клеток
Полуперевиваемые культуры клеток
Преимущества перевиваемых культур клеток перед первичными:
Использование культур клеток
Условия культивирования клеток:
Условия культивирования клеток:
Обнаружение = индикация вирусов в культуре клеток
ЦПД = видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов
Виды ЦПД
ЦПД вирусов
Включения
Тельца Бабеша-Негри
Бляшки, или “негативные” колонии
Реакция гемагглютинации (РГА)
Реакция гемадсорбции =РГАдс = способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Использование лабораторных животных
Способы заражения лабораторных животных
Обнаружение вируса при заражении лабораторных животных
Прионы
Прионы
Прионы
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Схема «размножения» прионов
БАКТЕРИОФАГИ
БАКТЕРИОФАГИ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Строение бактериофагов
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Нуклеиновая кислота фага
В состав головки входит:
В состав сокращающегося чехла входит:
Морфологические типы бактериофагов
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Классификация бактериофагов по спектру действия
Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку
Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку
Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку
Взаимодействие фагов с бактериями
Вирулентные бактериофаги
Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой
Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия
Взаимодействие бактериофага с оболочкой клетки
Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия
Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
Применение фагов
Практическое применение бактериофагов
Практическое применение бактериофагов
Практическое применение бактериофагов
Выделение бактериофага
Определение активности бактериофагов = фагоиндикация
Определение активности бактериофагов = фагоиндикация
Метод фагоиндикации = «стекающая капля» = «стерильная дорожка»
Определение активности бактериофагов = фагоиндикация
Титрование фага по Грациа
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Определение активности бактериофагов = фагоиндикация
Титрование фага по Аппельману
Фаготипирование бактерий
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
Фаготипирование стафилококков
Определение спектра литического действия фага
1/79
Средняя оценка: 4.6/5 (всего оценок: 75)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (1616 Кб)
1

Первый слайд презентации: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

Изображение слайда
2

Слайд 2: Способы культивирования вирусов

куриный эмбрион культура клеток организм лабораторного животного  обнаружение наличия вируса (индикация)  определение типа вируса (идентификация)

Изображение слайда
3

Слайд 3: Использование для вирусологического метода куриного эмбриона

5-7-дневные, реже – 10-11-дневные

Изображение слайда
4

Слайд 4: Основные способы заражения куриных эмбрионов

на хорион-аллантоисную оболочку в хорион-аллантоисную полость в полость желточного мешка в полость амниона в тело эмбриона

Изображение слайда
5

Слайд 5: Обнаружение вирусов в курином эмбрионе

индикация: гибель эмбриона морфологические изменения эмбриона/оболочек РГА с жидкостью из полостей куриного эмбриона идентификация : РН (в т.ч. РТГА) РСК

Изображение слайда
6

Слайд 6: Использование культур клеток

Культуры клеток = соматические или эмбриональные клетки человека или животных, культивируемые в лабораторных условиях. Подразделяют по числу жизнеспособных генераций на: - первичные, - перевиваемые, - полуперевиваемые.

Изображение слайда
7

Слайд 7: Первичные культуры клеток

получают из тканей ( эмбриональных или нормальных) многоклеточных организмов. Такие клетки не способны к делению – используются однократно. В основе получения лежит обработка протеолитическими ферментами (трипсином) = первично-трипсинизированные. Н-р, эмбриональная ткань человека, почечная ткань эмбрионов человека и обезьян.

Изображение слайда
8

Слайд 8: Перевиваемые культуры клеток

Перевиваемые = стабильные = готовят из опухолевых клеток, способных длительно размножаться in vitro не меняя своих свойств. Н-р, HeLa – выделены из карциномы шейки матки, Hep -2 – из карциномы гортани, Hep -3 – лимфокарцинома, KB – эпидермоидная карцинома полости рта, Детройт-6 – костный мозг больного раком легкого.

Изображение слайда
9

Слайд 9: Полуперевиваемые культуры клеток

– диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они сохраняют свои свойства в течение 20-50 пассажей (пересевов) = до года. При культивировании не претерпевают злокачественного перерождения – преимущество перед перевиваемыми → могут использоваться в производстве вакцин.

Изображение слайда
10

Слайд 10: Преимущества перевиваемых культур клеток перед первичными:

продолжительность культивирования – десятки лет, высокая скорость размножения, меньшая трудоемкость, сохраняют свои свойства в замороженном состоянии много лет, возможность использования международных линий культур. Но: злокачественный характер и возможность мутаций ограничивает применение для производства вакцин.

Изображение слайда
11

Слайд 11: Использование культур клеток

Чаще – перевиваемые монослойные индикация: ЦПД ( цитопатическое действие вирусов – любое изменение клеток монослоя, включая бляшкообразование и цветную пробу) гемадсорбирующая активность монослоя ( РГАдс ) РИФ (= идентификация) идентификация: РН (в т.ч. РТГАдс ) РСК РИФ

Изображение слайда
12

Слайд 12: Условия культивирования клеток:

Питательные среды сложного состава (среда 199, Игла), сод-т источники энергии (глюкозу), минеральные вещества, аминокислоты, витамины, сыворотку крови, факторы роста. Клетки чувствительны к изменениям рН – для контроля рН добавляют индикатор и буферные растворы. Соблюдение правил асептики. Использование лабораторной посуды из нейтрального стекла – пробирки, флаконы, матрасы ( =флакон 4-х гранной формы) Добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста бактерий Соблюдение оптимальной температуры культивирования (36-38,5 о ).

Изображение слайда
13

Слайд 13: Условия культивирования клеток:

Питательные среды сложного состава (среда 199, Игла), сод-т источники энергии (глюкозу), минеральные вещества, аминокислоты, витамины, сыворотку крови, факторы роста. Клетки чувствительны к изменениям рН – для контроля рН добавляют индикатор и буферные растворы. Соблюдение правил асептики. Использование лабораторной посуды из нейтрального стекла – пробирки, флаконы, матрасы ( =флакон 4-х гранной формы) Добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста бактерий Соблюдение оптимальной температуры культивирования (36-38,5 о ).

Изображение слайда
14

Слайд 14: Обнаружение = индикация вирусов в культуре клеток

проводят на основе следующих феноменов: - цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов или цитопатического эффекта, - образования внутриклеточных включений, - образования “бляшек”, - реакции гемагглютинации, гемадсорбции или “цветной” реакции.

Изображение слайда
15

Слайд 15: ЦПД = видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов

Культура клеток ЦПД вируса

Изображение слайда
16

Слайд 16: Виды ЦПД

округление и сморщивание клеток – пикорнавирусы, нарастающая деструкция – герпесвирусы, пролиферация (образование дырок) – поксвирусы, образование гигантских многоядерных клеток = симпласты – парамиксовирусы.

Изображение слайда
17

Слайд 17: ЦПД вирусов

Изображение слайда
18

Слайд 18: Включения

= скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Н-р, вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца Гварниери ; вирус бешенства в цитоплазме образует тельца Бабеша-Негри, вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.

Изображение слайда
19

Слайд 19: Тельца Бабеша-Негри

Изображение слайда
20

Слайд 20: Бляшки, или “негативные” колонии

= ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации.

Изображение слайда
21

Слайд 21: Реакция гемагглютинации (РГА)

основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.

Изображение слайда
22

Слайд 22: Реакция гемадсорбции =РГАдс = способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты

Изображение слайда
23

Слайд 23: Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Изображение слайда
24

Слайд 24: Использование лабораторных животных

взрослые или новорожденные белые мыши, хомяки, кролики, обезьяны применяется для выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток или курином эмбрионе, Вид и способ заражения – от вируса индикация: заболевание животного его гибель идентификация: РН

Изображение слайда
25

Слайд 25: Способы заражения лабораторных животных

интраназально, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, интрацеребрально,

Изображение слайда
26

Слайд 26: Обнаружение вируса при заражении лабораторных животных

обнаруживают вирус по: - развитию видимых клинических проявлений – параличи – рабдовирусы, -патоморфологическим изменениям органов и тканей – пикорна -, тогавирусы - в реакции гемагглютинации с суспензией из органов, недостаток: - высокая вероятность контаминации организма животных посторонними микробами, - необходимость заражения культуры клеток для выделения чистой культуры вируса.

Изображение слайда
27

Слайд 27: Прионы

– белковые молекулы, способные вызывать разрушение клеток организма человека и животных. Они характеризуются устойчивостью: к высоким температурам, ионизирующей радиации, ультрафиолету.

Изображение слайда
28

Слайд 28: Прионы

Прионный белок может существовать в двух формах : нормальная клеточная форма(Р rP c ) - обнаруживается в организме всех млекопитающих. Ген, кодирующий этот белок, расположен в коротком плече 20 хромосомы. Р rP c участвует в передаче нервных импульсов, в поддержании циркадных ритмов клетки,

Изображение слайда
29

Слайд 29: Прионы

инфекционная форма ( PrP s ) – характеризуется: измененной вторичной и третичной структурой молекулы, высокой устойчивостью к нагреванию, ультрафиолетовому свету, проникающей радиации и переваривающему действию протеаз.

Изображение слайда
30

Слайд 30

Изображение слайда
31

Слайд 31

Изображение слайда
32

Слайд 32

Изображение слайда
33

Слайд 33

Изображение слайда
34

Слайд 34: Схема «размножения» прионов

Изображение слайда
35

Слайд 35: БАКТЕРИОФАГИ

вирусы бактерий

Изображение слайда
36

Слайд 36: БАКТЕРИОФАГИ

«пожирающий бактерии» (от бактерия + греч. phagos – пожирающий) вирусы бактерий, специфически проникающие в бактериальные клетки и поражающие их. Для обозначения используют: название м/о, из которых они выделены: колифаги, стафилофаги, буквы латинского алфавита

Изображение слайда
37

Слайд 37

Изображение слайда
38

Слайд 38

Изображение слайда
39

Слайд 39: Строение бактериофагов

икосаэдрическая головка, хвостовой отросток: внутри – полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи - чехол отростка, заканчивающийся шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити), капсид головки и чехол хвостового отростка бактериофага состоят из полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (головка ) или спиральному (отросток ) типу симметрии.

Изображение слайда
40

Слайд 40

Изображение слайда
41

Слайд 41: Нуклеиновая кислота фага

Бактериофаги (фаги) содержат ДНК или РНК: - двунитевые - однонитевые линейные, -кольцевые. Большинство – двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо

Изображение слайда
42

Слайд 42: В состав головки входит:

полипептид, состоящий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина, - у некоторых – гистоноподобный белок → суперспирализация ДНК.

Изображение слайда
43

Слайд 43: В состав сокращающегося чехла входит:

у некоторых фагов входит АТФ и ионы кальция. В дистальной части отростка – лизоцим.

Изображение слайда
44

Слайд 44: Морфологические типы бактериофагов

I тип (нитчатые) без головки (только отросток) II тип без отростка (только головка) III тип головка и отросток, короткий без чехла IV тип головка и отросток, длинный с чехлом, не сократительный V тип головка и отросток, длинный с чехлом, сократительный

Изображение слайда
45

Слайд 45

Изображение слайда
46

Слайд 46: Классификация бактериофагов по спектру действия

полифаги поражают несколько видов монофаги (видовые) поражают один вид типовые фаги поражают часть вида ( фаговар )

Изображение слайда
47

Слайд 47: Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку

вирулентные умеренные

Изображение слайда
48

Слайд 48: Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку

вирулентный фаг лизис вирулентный фаг дефектный фаг общая абортивная трансдукция

Изображение слайда
49

Слайд 49: Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку

умеренный фаг лизогения без изменения фенотипа бактерии с изменением фенотипа бактерии ( фаговая конверсия ) лизис умеренный дефектный специализированная трансдукция

Изображение слайда
50

Слайд 50: Взаимодействие фагов с бактериями

может происходить: - по продуктивному типу – вирулентные фаги → фаговое потомство, бактерии лизируются - интегративному – умеренные →встраиваются в геном клетки и сосуществуют с ней, - абортивному типу → фаговое потомство не образуется, бактерии сохраняют свою жизнедеятельность

Изображение слайда
51

Слайд 51: Вирулентные бактериофаги

попав в бактерию, реплицируются, формируя 200-300 фаговых частиц, и вызывают гибель (лизис) бактерии = это продуктивный тип взаимодействия

Изображение слайда
52

Слайд 52: Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой

адсорбция фага на специальных рецепторах КС (на протопластах не происходит) проникновение НК ( депротеинизация ) репликация фаговой НК и синтез фаговых белков сборка фаговых частиц выход зрелых фагов лизис бактерии бактерия не погибает («взрыв») (некоторые нитчатые фаги) ПРОДУКТИВНАЯ ИНФЕКЦИЯ

Изображение слайда
53

Слайд 53: Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия

1. Бактериофаги с сокращающимся чехлом адсорбируются на клеточной стенке с помощью фибрилл хвостового отростка. 2. Чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью ферментов (лизоцима) просверливает оболочку клетки. 3. Через канал стержня  бактериофага нуклеиновая кислота  инъецируется из головки в бактериальную клетку, а капсид бактериофага остается снаружи бактерии.

Изображение слайда
54

Слайд 54: Взаимодействие бактериофага с оболочкой клетки

Изображение слайда
55

Слайд 55: Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия

4. Инъецированная внутрь клетки нуклеиновая кислота подавляет биосинтез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки бактериофага : происходит полный распад ДНК бактерии и ее утилизация. е сли ДНК бактерии не хватает для образования фаговой ДНК – она синтезируется из компонентов среды.

Изображение слайда
56

Слайд 56: Этапы взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой = продуктивный тип взаимодействия

5. Образовавшиеся в разных частях клетки компоненты бактериофага собираются в фаговые частицы путем заполнения фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых капсидов головки 6. Сформированная головка соединяется с хвостовой частью, образуя новый фаг. Затем в результате лизиса клетки бактериофаги выходят из нее.

Изображение слайда
57

Слайд 57: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

адсорбция фага на специальных рецепторах КС (на протопластах не происходит) проникновение НК ( депротеинизация ) интеграция фаговой НК в геном бактерии профаг ( фаговый репрессор блокирует транскрипцию) лизогенная культура Л И З О Г Е Н И З А Ц И Я в дальнейшем – может индукция профага продуктивная инфекция

Изображение слайда
58

Слайд 58: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

Умеренные бактериофаги взаимодействуют с бактериями: - либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет как и у вирулентных фагов, и заканчивается лизисом бактерий.

Изображение слайда
59

Слайд 59: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

При интегративном типе ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии: - приобретает форму кольца, - интегрируется в гомологичную область, - реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса (передается при делении бактерии).

Изображение слайда
60

Слайд 60: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, культура бактерий — лизогенной ; сам процесс – лизогенией (от греч. lysis – разложение, genea – происхождение).

Изображение слайда
61

Слайд 61: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

При лизогении фаги не образуются в результате “выключения“ фаговых генов репрессором ( =низкомолекулярный белок), кодируемым одним геном фага. Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующих агентов ( УФ-лучи, митомицин С и др.) дерепрессироваться, исключаться из хромосомы. Этот процесс заканчивается продукцией фагов ( индукция профага ) и лизисом бактерий.

Изображение слайда
62

Слайд 62: Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

Профаг придает бактерии новые свойства, что получило название фаговой конверсии (лат. conversio – превращение). Конвертироваться могут: морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Изображение слайда
63

Слайд 63: Применение фагов

для профилактики, для лечения инфекций, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантной ДНК, для диагностики (например, для фаготипирования с целью выявления источника инфекции или внутривидовой идентификации).

Изображение слайда
64

Слайд 64: Практическое применение бактериофагов

Фагопрофилактика брюшной тиф дизентерия

Изображение слайда
65

Слайд 65: Практическое применение бактериофагов

Фаготерапия Фаг применяется в том случае, когда антибиотики применять нельзя, Чаще всего местно

Изображение слайда
66

Слайд 66: Практическое применение бактериофагов

Фагодиагностика Выявление определённого вида бактерий в патологическом материале реакция нарастания титра фага Идентификация чистой культуры определение вида фагоиндикация определение фаговара фаготипирование

Изображение слайда
67

Слайд 67: Выделение бактериофага

материал объект внешней среды бактериальная культура  бактериальный фильтр  фильтрат  МПБ + чувствительная бактерия  Инкубация 24 час  роста нет – фаг присутствует (очищают фильтрованием) рост есть – фаг отсутствует

Изображение слайда
68

Слайд 68: Определение активности бактериофагов = фагоиндикация

Качественный метод: метод «стерильной дорожки» Количественные методы: А) Метод Грациа Б) Метод Аппельмана

Изображение слайда
69

Слайд 69: Определение активности бактериофагов = фагоиндикация

Качественный метод : На чашку газоном засевают культуру микроорганизмов, наносят каплю бактериофага и дают ей стечь. Чашки инкубируют при 37 градусах 24 час и учитывают результат : там, где стекал бактериофаг, образовалась « стерильная дорожка»

Изображение слайда
70

Слайд 70: Метод фагоиндикации = «стекающая капля» = «стерильная дорожка»

стекающая капля по газону засеянной культуры  регистрация роста бактерий в месте стекания капли  рост есть – - роста нет – + «стерильная дорожка»

Изображение слайда
71

Слайд 71: Определение активности бактериофагов = фагоиндикация

Количественные методы : А) Метод Грациа : готовят десятикратные разведения фага в хлориде натрия от 10 -2 до 10 -7 Затем по 0,5 мл из каждого разведения смешивают с таким же объемом бульонной культуры и 4 мл расплавленного и остуженного до 45 град. агара и выливают на чашки Петри. Когда агар застынет чашки помещают в термостат при 37 градусах на 24 часа и затем учитывают результаты: - одна фаговая частица образует одно «стерильное пятно» - Величина, показывающая концентрацию фага называется титром.

Изображение слайда
72

Слайд 72: Титрование фага по Грациа

МПА + разведение фагосодержащего материала + чувствительная культура МПА (подложка) чашка Петри со средой (в разрезе)

Изображение слайда
73

Слайд 73

Изображение слайда
74

Слайд 74: Определение активности бактериофагов = фагоиндикация

Количественные методы : Б) Метод Аппельмана : готовят десятикратные разведения фага в питательном бульоне от 10 -2 до 10 -8. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,2мл бульонной культуры и ряды ставят в термостат. После инкубации в термостате учитывают результаты: = в положительном случае наблюдается просветление среды. Разведение в последней пробирке, где произошел полный лизис культуры, называется титром фага.

Изображение слайда
75

Слайд 75: Титрование фага по Аппельману

Изображение слайда
76

Слайд 76: Фаготипирование бактерий

засев газоном на чашку с питательным агаром изучаемого штамма чашку делят на квадратики и на каждый наносят бактериофаг инкубация регистрация «стерильных пятен» («бляшек») фаготип (фаговар) = перечень типовых фагов, лизирующих данный вариант

Изображение слайда
77

Слайд 77

Изображение слайда
78

Слайд 78: Фаготипирование стафилококков

Изображение слайда
79

Последний слайд презентации: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ: Определение спектра литического действия фага

Чашку делят на квадратики и на каждый газоном засевают испытуемые штаммы, затем на каждый квадратик петлей или пипеткой наносят каплю фага после инкубации в термостате в течение 24 час определяют наличие «стерильных пятен». Количество культур, которые лизирует бактериофаг – спектр его литического действия.

Изображение слайда