Презентация на тему: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Генетика главного комплекса гистосовместимости
Генетика главного комплекса гистосовместимости
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Строение главного комплекса гистосовместимости человека
Упрощенная молекулярная карта главного комплекса гистосовместимости человека
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основные принципы и механизмы ассоциации антигенов системы HLA с заболеваниями
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Методика определения антигенов системы HLA І класса
Реактивы:
Оборудование:
Ход определения
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР с мечеными, специфичными по своей последовательности олигонуклеотидами (ПЦР-СПО)
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР со специфичными по своей последовательности праймерами (ПЦР-СПП)
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основные этапы мультиплексного HLA - генотипирования
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Частота HLA-антигенов у здоровых лиц г.Харькова (n=1330)
Генетическое расстояние HLA-антигенов между харьковской и другими популяциями
НЕКОТОРЫЕ HLA -АССОЦИИРОВАННЫЕ БОЛЕЗНИ
НЕКОТОРЫЕ HLA -АССОЦИИРОВАННЫЕ БОЛЕЗНИ
1/34
Средняя оценка: 4.4/5 (всего оценок: 89)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (1093 Кб)
1

Первый слайд презентации: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лекция 6

Изображение слайда
2

Слайд 2: Генетика главного комплекса гистосовместимости

MHC (HLA-система ) – обширный геномный регион (семейство генов), расположенный на коротком плече 6-й хромосомы человека. Эти гены имеют большое количество вариантов (аллелей), то есть обладают очень высоким полиморфизмом. Генетика главного комплекса гистосовместимости

Изображение слайда
3

Слайд 3: Генетика главного комплекса гистосовместимости

Спектр аллелей каждого гена комплекса HLA уникален для каждого организма и определяет его биологическую индивидуальность. Существует более триллиона комбинаций, и практически невозможно найти людей, имеющих одинаковые сочетания HLA-антигенов (за исключением однояйцевых близнецов).

Изображение слайда
4

Слайд 4

Гены HLA группируются в подсемейства (локусы): A, B и С кодируют антигены I класса, D - антигены II класса. Названия генов и антигенов HLA состоят из одной или нескольких букв и цифр, например A3, B45, DR15, DQ4. Буква обозначает ген (область и локус), а цифры - аллель этого гена (при этом цифровые обозначения присваиваются по мере открытия новых аллелей).

Изображение слайда
5

Слайд 5

По современным представлениям система HLA обеспечивает регуляцию иммунного ответа, контролируя такие важнейшие физиологические функции, как взаимодействие иммунокомпетентных клеток организма, распознавание клеток, запуск и реализация иммунного ответа. Сходный генетический регион найден у всех позвоночных и получил название «главный комплекс гистосовместимости» - Major Histocompatibility Complex (MHC).

Изображение слайда
6

Слайд 6: Строение главного комплекса гистосовместимости человека

Изображение слайда
7

Слайд 7: Упрощенная молекулярная карта главного комплекса гистосовместимости человека

Изображение слайда
8

Слайд 8

В соответствии с биохимическим строением и функцией HLA-антигены подразделяются на антигены класса I, антигены класса II и антигены класса III. ► HLA-антигены класса I кодируются генами локусов A, B и C и являются так называемыми трансплантационными антигенами. Они присутствуют на поверхности всех ядросодержащих клеток. HLA-антигены класса I необходимы для распознавания трансформированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Изображение слайда
9

Слайд 9

► HLA-антигены класса II кодируются генами локусов DR, DP, DQ. Они располагаются в основном на мембранах B-лимфоцитов, активированных T-лимфоцитов, лейкоцитов, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Гены этого класса контролируют силу иммунного ответа. ► HLA-антигены класса III являются компонентами системы комплемента и цитокинами; кодируются генами локусов С2, С4а, С4в и др. Они контролируют синтез молекул комплемента - неспецифического фактора иммунной защиты организма.

Изображение слайда
10

Слайд 10

Аллельные варианты генов HLA-системы могут быть определены методом аллель-специфичной ПЦР. В зависимости от цели исследования, проводится либо полное HLA-типирование, либо типирование отдельных семейств генов. В случае выяснения предрасположенности пациента к одному из заболеваний, связанных с определёнными сочетаниями аллелей, возможно типирование только этих вариантов генов. Например, при исследовании аллелей ряда генов HLA обнаружена взаимосвязь в виде повышенного риска возникновения таких заболеваний как сахарный диабет I типа, ревматоидные заболевания, аутоиммунный тиреоидит, восприимчивость к инфекционным заболеваниям и других.

Изображение слайда
11

Слайд 11: Основные принципы и механизмы ассоциации антигенов системы HLA с заболеваниями

1. Генетический контроль иммунного ответа. Ассоциации HLA -антигенов с различными патологическими состояниями являются следствием аномального функционирования Ir -генов. Будучи сцепленными с HLA -локусами, они обусловливают возникновение различных дефектов иммунитета, полагают, что сублокус HLA - D находится в I -области, в которой и расположены гены иммунного ответа, ответственные за его силу.

Изображение слайда
12

Слайд 12

Данные об ассоциации между МНС комплексом и болезнями является подтверждением наличия связи генов иммунного ответа с HLA -системой. Установлено увеличение частоты гаплотипа А1, В8, DR 3 у больных с аутоиммунными заболеваниями. С указанными аллелями ассоциирована группа генов, определяющих высокую реактивность к различным агентам. У лиц с этими антигенами значительно снижена функциональная активность Т- супрессоров и высокий иммунный ответ на стимуляцию поликлональными антигенами. С HLA -А3, В7, DR 2 ассоциированы многие заболевания, для которых характерен сниженный иммунитет.

Изображение слайда
13

Слайд 13

2. Детерминантная теория заключается в том, что ассоциированные с заболеванием HLA -молекулы обладают способностью связывать чужеродные пептиды или аутоантигены в специальные конфигурации, которые запускают Т-клеточноопосредованные заболевания.

Изображение слайда
14

Слайд 14

3. Теория молекулярной мимикрии состоит в том, что в результате идентичности антигенных детерминант возбудителя (вируса или бактерии) с определенными HLA -молекулами или их фрагментами не наступает распознавание «чужого» и развитие адекватного иммунного ответа, в результате чего возбудитель «безнаказанно» поражает организм человека. Именно с помощью данной теории объясняют развитие HLA -В27- ассоциированных заболеваний (болезни органов движения). Поражения костно-мышечной системы вызываются микробными агентами: иерсиниями, клебсиеллами, шигеллами, сальмонеллами, хламидиями, кампилобактериями. Эти бактерии являются перекрестно реагирующими с HLA -В27, что приводит к развитию заболеваний.

Изображение слайда
15

Слайд 15

4. Рецепторная теор ия – чужеродный агент взаимодействует непосредственно с определенными антигенами гистосовместимости, обладая повышенной тропностью к ним. Примером может являться развитие вирусного гепатита В, ассоциированного с наличием антигенов HLA -В18 и В35. 5. Гипотеза модификации HLA -молекул заключается в следующем: антигены HLA, модифицированные инфекционным или другим агентом, распознаются в организме как «чужие» и против них развивается иммунный ответ (аутоиммунные заболевания – СД, ревматические болезни, заболевания щитовидной железы).

Изображение слайда
16

Слайд 16

6. Теория тимической селекции – недостаток презентации пептидов HLA -аллелями во время тимической дифференциации, что приводит к развитию аутоагрессии патологических Т-клеток. Существуют и другие теории, объясняющие взаимосвязь между системой HLA и заболеваниями, которые требуют дальнейшего всестороннего дальнейшего изучения.

Изображение слайда
17

Слайд 17

Функциональное значение главного комплекса гистосовместимости заключается в реализации важных биологических феноменов: трансплантации органов и тканей; генетическом контроле иммунного ответа; межклеточном взаимодействии; осуществлении контроля активности комплемента; регуляции уровня и синтеза стероидных гормонов, процессов эмбриогенеза, уровня цАМФ ; обеспечении резистентности или восприимчивости организма к ряду заболеваний. Практическое значение. В клинической лабораторной диагностике типирование аллелей 1 класса HLA имеет важное значение в определении оптимальной гистосовместимости для поиска доноров при аллогенной трансплантации почек и костного мозга. Клиническое значение имеет также идентификация В27 у пациентов анкилозирующим спондилитом (болезнь Бехтерева) и ряда других заболеваний из группы коллагенозов, ревматических заболеваний.

Изображение слайда
18

Слайд 18: Методика определения антигенов системы HLA І класса

По Терасаки в модификации Ж. Доссе в стандартном двухступенчатом микролимфоцитотоксическом тесте. Принцип метода : двухэтапное влияние на лимфоциты периферической крови сначала иммунной сывороткой, которая удерживает антитела известной специфичности, а потом комплемента. Если лимфоциты имеют определенный антиген системы HLA, то состоится реакция клеточного лизиса, которая определяется проникновением в клетку красителя.

Изображение слайда
19

Слайд 19: Реактивы:

1.гистотипирующая панель HLA- А, В; 2. кроличий комплемент (1мл лиофилизированного кроличьего комплемента развести в 1мл дестиллированной воды); 3. градиент плотности « градимекс-верографин » (1,077г/см 3 ) 4. раствор Хенкса 5. вазелиновое масло; 6. формалин 17% 7. раствор эозина К 5%. 8.раствор гепарина (1лм гепарина (5 тис. единиц) растворить в 14мл физиологического раствора) 9. раствор NaCl 10%.

Изображение слайда
20

Слайд 20: Оборудование:

1. микропланшеты ; 2. микрошприцы ; 3. весы лабораторные ВЛТ-200; 4. центрифуга рефрижераторная РС-6; 5. центрифуга ОПН-3; 6. камера Горяева; 7. микроскоп.

Изображение слайда
21

Слайд 21: Ход определения

1. Перед использованием разморозить микропланшеты, которые содержат в каждой лунке по 1мкл анти-HLA-сыворотки в течение 10-15 минут. 2. В каждую лунку HLA-А, В планшеты добавить 1мкл суспензии лимфоцитов. 3. Инкубировать при комнатной температуре (20°) в течении 30 минут. 4. Добавить 5 мкл кроличьего комплемента. 5. Инкубировать при комнатной температуре (20°) в течение 60 минут. 6. Добавить 3 мкл 5% раствора эозина, через 5 мин. 5 мкл формальдегида (37%) для фиксации. 7. Учет реакции проводить не раньше, чем через 30 минут.

Изображение слайда
22

Слайд 22

В настоящее время для типирования HLA используются следующие методы ПЦР: 1. ПЦР с мечеными, специфичными по своей последовательности олигонуклеотидами (ПЦР-СПО); 2. ПЦР со специфическими по своей последовательности праймерами (ПЦР-СПП), которые занимают главное место в лабораторной диагностики гистотипирования для алогенной трансплантации почек и костного мозга.

Изображение слайда
23

Слайд 23: ПЦР с мечеными, специфичными по своей последовательности олигонуклеотидами (ПЦР-СПО)

Вначале в ПЦР-СПО амплифицируют районы матричной ДНК отдельных генов HLA региона. Продукты амплификации фиксируют на нейлоновой мембране и гибридизируют со специфичными по своей последовательности, химически или радиактивно мечеными, олигонуклеотидами. Определение конкретного аллеля основано на том, что при достаточном выборе олигонуклеотидов, положительная гибридизация имеет место в том случае, когда определенный олигонуклеотид комплементарен соответствующей последовательности на амплифицированных продуктах матричной ДНК.

Изображение слайда
24

Слайд 24

При наличии достаточного количества специфических праймеров и олигонуклеотидов метод СПО позволяет идентифицировать все известные аллели локуса. Для всех импринтированных генных локусов II класса существуют хорошо отработанные протоколы СПО, даже с высокой распределительной способностью.

Изображение слайда
25

Слайд 25: ПЦР со специфичными по своей последовательности праймерами (ПЦР-СПП)

Принцип ПЦР-СПП ( аллельспецифичная амплификация) состоит в том, что амплификация специфичного продукта в ПЦР осуществляется только в том случае, когда 3′ - конец праймера комплементарен к целевой последовательности матричной ДНК. Одно единственное различие между последовательностями нуклеотидов матричной ДНК и соответствующего праймера мешает амплификации в ПЦР, что обусловливает высокую специфичность метода СПП в идентификации аллелей. Для контроля амплификации к каждой пробе добавляется еще одна пара праймеров. Она обеспечивает создание продукта ПЦР при любых условиях амплификации, независимо от типа HLA.

Изображение слайда
26

Слайд 26

В отличие от метода СПО (от 1 до 3 суток), идентификация отдельных аллелей осуществляется на основе амплификации (гибридизация не нужна). Разделение отдельных аллелей или их групп осуществляется на основе амплификации при электрофорезе в агарозном геле, где продукты ПЦР разделяют по их длине и визуализируют в ультрафиолетовом излучении (1-2 часа).

Изображение слайда
27

Слайд 27: Основные этапы мультиплексного HLA - генотипирования

Изображение слайда
28

Слайд 28

Высокий полиморфизм делает систему HLA великолепным маркером в популяционно-генетических исследованиях и изучении генетической предрасположенности к заболеваниям.

Изображение слайда
29

Слайд 29

Популяционные исследования, проведенные во многих странах мира, выявили характерные различия в распределении HLA-антигенов в разных популяциях. Особенности распределения HLA-антигенов используются в генетических исследованиях для изучения структуры, происхождения и эволюции различных популяций. Например, грузинская популяция относится к южным европеоидам, имеет сходные черты HLA-генетического профиля с греческой, болгарской, испанской популяциями, указывающими на общность их происхождения. Эти особенности учитываются при изучении связи HLA с заболеваниями.

Изображение слайда
30

Слайд 30

В популяциях, различающихся по HLA-генетическому профилю, могут выявляться разные HLA-маркеры одной и той же болезни.

Изображение слайда
31

Слайд 31: Частота HLA-антигенов у здоровых лиц г.Харькова (n=1330)

HLA- антиген Частота HLA- антиген Частота антигена, % гена антигена, % гена А1 21,7 0,115 В12 16,5 0,086 А2 51,1 0,391 В15 9,0 0,046 А3 23,2 0,124 В16 13,2 0,068 А9 21,1 0,112 B27 13,2 0,068 А10 23,9 0,128 B35 16,2 0,084 А24 0,5 0,002 B38 2,6 0,013 А25 4,5 0,023 В40 7,9 0,040 А26 0,8 0,004 Cw1 3,9 0,019 А28 9,6 0,049 Cw2 13,5 0,070 В5 14,8 0,077 Cw3 11,1 0,057 В7 19,8 0,104 Cw4 20,7 0,109 В8 10,8 0,852 Cw5 2,9 0,015

Изображение слайда
32

Слайд 32: Генетическое расстояние HLA-антигенов между харьковской и другими популяциями

Популяции Генетическое расстояние Киевская 0,0152*** Московская 0,0139*** Санкт-Петербургская 0,0196*** Европейская 0,0287***

Изображение слайда
33

Слайд 33: НЕКОТОРЫЕ HLA -АССОЦИИРОВАННЫЕ БОЛЕЗНИ

Заболевание Больные, % Здоровые, % Относитель-ный риск Нарколепсия DR 2 (К) DR 2 (М) 100 100 22 34 129,8 358,1 Анкилозирующий спондилит В27 (К) В27 (М) В27 (Н) 89 85 58 9 15 4 69,1 207,9 54,4 Ревматоидный артрит В27 (К) DR 4 (К) 16 68 9 25 2,0 3,8 Ювенильный ревматоидный артрит В27 (К) DR 5 (К) 25 34 9 15 3,9 3,3

Изображение слайда
34

Последний слайд презентации: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: НЕКОТОРЫЕ HLA -АССОЦИИРОВАННЫЕ БОЛЕЗНИ

Заболевание Больные, % Здоровые, % Относительный риск Болезнь Рейтера В27 (К) 80 9 37,1 СД 1 типа В8 (К) В15 (К)-(Н) DR 3 (К) DR 4 (К)-(Н) 40 22 46 51 21 14 22 25 2,5 2,1-2,2 3,3 3,6-6,7 Системна красная волчанка В8 (К) DR 3 (К) 40 42 20 21 2,7 2,6 Рассеянный склероз В7 (К) DR 2 (К) 37 51 24 27 1,8 2,7 ЗПР А28 В40 В51 DR 1 23,4 22,3 11,4 42,2 11,7 8,9 0,6 11,1 2,3 3,0 21,3 3,3

Изображение слайда