Презентация на тему: Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку

Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку
Трансформация
Трансформация методика
Трансформация методика (продолжение)
Конъюгация.
Вирусная инфекция.
Перфорационные методы.
Другие перфорационные методы
Трансфекция
Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза ( а ). Схематичное изображение частицы из нелипидного
Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплек- са поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза
Структура комплекса с ДНК ( а ) и общая структура катионного липидного полимера ( б ).
Микроинъекция
Баллистическая трансфекция ( биобаллистика)
Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразово- го «генного пистолета»
Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку.
Проблемы экспрессии чужеродных генов
Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку
Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку
Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов
Причины необходимости отсутствия маркерных генов в трансгенных организмах
Методы получения безмаркерных организмов
1/22
Средняя оценка: 4.6/5 (всего оценок: 20)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (854 Кб)
1

Первый слайд презентации: Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку

Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспе-риментатора.

Изображение слайда
2

Слайд 2: Трансформация

Трансформация в самом общем значении – это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурны фазовым переходом клеточной мембраны.

Изображение слайда
3

Слайд 3: Трансформация методика

Клетки выдерживают с ледяным раствором СаС1 2 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, при этом составляет примерно 10 5 –10 7. Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными

Изображение слайда
4

Слайд 4: Трансформация методика (продолжение)

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов – клеток, частично или полностью (протопласты), лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз.

Изображение слайда
5

Слайд 5: Конъюгация

Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты,через которые они и переходят из одной клетки в другую. конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз.

Изображение слайда
6

Слайд 6: Вирусная инфекция

Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса

Изображение слайда
7

Слайд 7: Перфорационные методы

электропорация – временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействие электрического поля. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12–18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см.

Изображение слайда
8

Слайд 8: Другие перфорационные методы

Обработка клеток ультразвуком Центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией Осмотическая перфорация плазматической мембраны Пробой клетки лазерным микролучом Использование порообразующего токсина стрептолизина-O

Изображение слайда
9

Слайд 9: Трансфекция

Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.

Изображение слайда
10

Слайд 10: Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза ( а ). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером ( б )

Изображение слайда
11

Слайд 11: Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплек- са поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза

Изображение слайда
12

Слайд 12: Структура комплекса с ДНК ( а ) и общая структура катионного липидного полимера ( б )

Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом ( а ) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть

Изображение слайда
13

Слайд 13: Микроинъекция

Клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки

Изображение слайда
14

Слайд 14: Баллистическая трансфекция ( биобаллистика)

Биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1-2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Требуется «генный пистолет»

Изображение слайда
15

Слайд 15: Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразово- го «генного пистолета»

Изображение слайда
16

Слайд 16: Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку

Различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время.

Изображение слайда
17

Слайд 17: Проблемы экспрессии чужеродных генов

Основная задача гетерологичной экспрессии в биотехнологии – получение в больших количествах функционально активного белка в природной конформации с корректными посттрансляционными модификациями. Еще одним условием биотехнологического производства считается минимизация затрат на единицу продукции.

Изображение слайда
18

Слайд 18

Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций. 1. Образование дисульфидных связей. Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным. 2. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка. 3. Гликозилирование – основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях – особые свойства. Наиболее распространенная реакция гликолизирования – это присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликолизирование). 4. Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование, пальмитоилирование и др.

Изображение слайда
19

Слайд 19

Уровень экспрессии чужеродного гена также зависит от конструкции экспрессионной кассеты вектора. Коммерческие векторы обычно содержат в составе экспрессионной кассеты весь необходимый набор регуляторных элементов для высокоэффективной генной экспрессии в конкретной клетке-мишени (или универсальные элементы для нескольких хозяев). Помимо этого, для лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для клетки-хозяина. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют «редкие» кодоны на синонимичные «частые», что не сказывается на первичной структуре белка.

Изображение слайда
20

Слайд 20: Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов

Используются различные методы селекции для выделения трансформированных клеток. В состав рекомбинантных генетических конструкций вводят специальные гены селекции, например, гены устойчивости к антибиотикам и/или репортерные (маркерные) гены, кодирующие какой-либо легко идентифицируемый признак (окраска клеток флуоресцентными белками).

Изображение слайда
21

Слайд 21: Причины необходимости отсутствия маркерных генов в трансгенных организмах

Потребность минимизировать воздействие на уже сформированный в процессе длительной эволюции генетический аппарат клетки-хозяина и убрать дополнительную метаболическую нагрузку клетки на экспрессию маркерного гена. Озабоченность общественного мнения неконтролируемым распространением в окружающей среде селективных и маркерных генов и, прежде всего, генов устойчивости к антибиотикам Проблемы у потребителей ГМО, вызванные в редких случаях балластным продуктом маркерного гена, например, аллергические реакции на продукт маркерного гена у животных и человека при потреблении генетически модифицированных растений. Необходимость удаления маркерного гена, уже использованного для селекции. Это важно при последовательном введении нескольких генетических конструкций в один организм, поскольку количество эффективных селективных генов ограничено.

Изображение слайда
22

Последний слайд презентации: Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку: Методы получения безмаркерных организмов

Котрансфекция одного организма двумя генетическими конструкциями: одна – с целевым геном, другая – с маркерным. Далее маркерный ген можно удалить с помощью обычного скрещивания. использование подвижных генетических элементов для перемещения маркерного гена в другой хромосомный сайт(ген транспозаза) трансгенного организма. Далее маркерный ген также удаляют скрещиванием

Изображение слайда