Презентация на тему: БИОТЕХНОЛОГИЯ

БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
1/46
Средняя оценка: 4.8/5 (всего оценок: 7)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (2267 Кб)
1

Первый слайд презентации: БИОТЕХНОЛОГИЯ

Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Направление 020400 Биология Профиль Общая биология Профессор кафедры Зоологии д.б.н., проф. Цымбаленко Надежда Васильевна

Изображение слайда
2

Слайд 2

Вспомогательные методы для технологии рекомбинантной ДНК

Изображение слайда
3

Слайд 3

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДНК Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать: для конструирования целых генов или их фрагментов для амплификации специфических фрагментов ДНК для направленных мутаций изолированных ДНК в качестве зондов при гибридизации в качестве линкеров, облегчающих клонирование

Изображение слайда
4

Слайд 4

Нуклеотиды соединяются друг с другом в полимерную цепочку с помощью фосфодиэфирных связей.

Изображение слайда
5

Слайд 5

Фосфорамидитный метод – наиболее распространенный метод синтеза дезоксиолигонуклеотидов в настоящее время. Исходные строительные блоки – модифицированные дезоксирибонуклеозиды. Модификация состоит в присоединении к аминогруппам дезоксиаденозина и дезоксицидина бензольной группы, а к аминогруппе дезоксигуанозина – изобутиральной. Тимидин, у которого аминогруппа отсутствует, не модифицируют. Такая модификация необходима для защиты нуклеозидов от нежелательных побочных эффектов.

Изображение слайда
6

Слайд 6

Структурная формула фосфорамидита Такие производные всех четырех оснований – A, T, G и C – используются для химического синтеза ДНК. ДМТ – диметокситритил Ме – метильная группа

Изображение слайда
7

Слайд 7

Синтез осуществляется в твердой фазе (растущая цепь ДНК фиксируется на твердом носителе), что позволяет проводить все реакции в одной емкости, легко отмывать после каждого этапа ненужные реагенты и добавлять новые в количестве, оптимальном для полного протекания реакции. Первый нуклеозид фиксируют на твердом носителе с помощью химического спейсера. Обычно это пористые стеклянные шарики с порами одинакового размера.

Изображение слайда
8

Слайд 8

Первый нуклеозид фиксируют на твердом носителе с помощью химического спейсера. Обычно это пористые стеклянные шарики с порами одинакового размера.

Изображение слайда
9

Слайд 9

Схема химического синтеза олигонуклеотида. После n циклов образуется одноцепочечный фрагмент ДНК из n +1 нуклеотида.

Изображение слайда
10

Слайд 10

Цикл начинается после присоединения первого нуклеозида к стеклянному шарику промывают безводным растворителем (ацетонитрил), остатки которого удаляют продуванием аргона промывают ТХУ (трихлоруксусная кислота) для отщепления ДМТ (детритилирование) опять промывают растворителем и ТХУ, продувают аргон и на этом этапе вводят следующий нуклеозид в виде фосфоримидита и тетразол, который активирует фосфорамидит, несвязавшиеся реагенты удаляют продуванием аргона.

Изображение слайда
11

Слайд 11

Детритилирование — отщепление 5'-диметокситритильной  (ДМТ) группы с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Изображение слайда
12

Слайд 12

Изображение слайда
13

Слайд 13

! Поскольку по окончании первого этапа не все фиксированные на носителе нуклеозиды оказываются связанными с фосфорамидитом, необходимо предотвратить их взаимодействие с нуклеозидом, добавленным на втором этапе. Для этого непрореагировавшую 5 ’ – ОН группу ацетилируют с помощью уксусного ангидрида и диметиламинопиридина (кэппирование). !! Нестабильную фосфиттриэфирную связь, образовавшуюся на втором этапе между нуклеотидами с помощью иодной смеси окисляют до пятивалентного фосфаттриэфира.

Изображение слайда
14

Слайд 14

Все описанные операции проводят до тех пор, пока к растущей цепи в соответствии с программой не присоединится последний нуклеозид. !!! Метильные группы удаляют с помощью химической обработки непосредственно в реакционной колонке. Затем отсоединяют олигонуклеотиды от спейсерной молекулы вместе с 3 ’ –ОН концом и элюируют их из колонки; затем последовательно удаляют бензоильные, изобутиральные и ДМТ-группы. 5 ’ –конец цепи фосфорилируют ферментативным (полинуклеотидкиназа+АТФ) или химическим методом.

Изображение слайда
15

Слайд 15

Синтез генов Первый подход : Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый. Нуклеотидные последовательности цепей задают так, чтобы после отжига концевые сегменты гена имели тупые концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие 3 ’ – и 5 ’ – концы, комплементарные таковым соседнего сегмента, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.

Изображение слайда
16

Слайд 16

Изображение слайда
17

Слайд 17

Второй подход: Сборка протяженного гена in vitro с участием ферментов. Вначале химическими методами синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге между ними образовались спаренные участки длиной 6-10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I E. coli, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4

Изображение слайда
18

Слайд 18

Изображение слайда
19

Слайд 19

Секвенирование ДНК Исчерпывающую информацию о молекуле ДНК можно получить, только определив ее нуклеотидную последовательность.

Изображение слайда
20

Слайд 20

Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК Дидезоксинуклеотид – это полученный искусственным путем нуклеотид, лишенный 2 ’ – и 3 ’ – ОН групп при углеродных атомах сахарного кольца. При присоединении такого нуклеотида во время роста полинуклеотидной цепи синтез останавливается.

Изображение слайда
21

Слайд 21

Остановка синтеза ДНК – ключевой этап дидезокси-метода, но чтобы осуществить секвенирование в полном объеме, необходимо выполнить целый ряд условий:

Изображение слайда
22

Слайд 22

1. Гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17-20 звеньев со специфическим участком одной из цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является донором 3 – ОН для инициации синтеза. 2. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dTTP, dCTP и dGTP (один из них – меченый),и один из четырех дидезоксинуклеотидов ( ddATP, ddTTP, ddCTP и ddGTP ) в рассчитанной концентрации. После присоединения ddNTP синтез сразу останавливается. Т.о. в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигонуклеотидов, каждый из которых содержит праймерную последовательность.

Изображение слайда
23

Слайд 23

3. В пробирки добавляют формамид, чтобы обеспечить расхождение цепей, и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Это позволяет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК, даже если они различаются по длине всего на один нуклеотид. На радиоавтографе обнаруживается набор полос, отвечающих меченым фрагментам ДНК, сопоставление которых позволяет прямо “прочитать” нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. Нуклеотидная последовательность считывается с радиоавтографа снизу вверх.

Изображение слайда
24

Слайд 24

Изображение слайда
25

Слайд 25

Автоматическое секвенирование

Изображение слайда
26

Слайд 26

Молекулярная гибридизация Процесс гибридизации, т.е. образования водородных связей между основаниями нуклеотидов происходит между любыми одноцепочечными полинуклеотидами, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК

Изображение слайда
27

Слайд 27

Гибридизация нуклеиновых кислот 1. Двухцепочечную ДНК нагревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки полинуклеотидов расходятся. 2. Препарат денатурированных ДНК затем смешивают с другой денатурированной ДНК, или РНК. 3. Препараты далее медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется “ гибридная молекула ”.

Изображение слайда
28

Слайд 28

Анализ скорости отжига одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида. Гибридизация нуклеиновых кислот представляет собой высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов и применяется в различных модификациях как в растворе, так и на твердых подложках, например на нитроцеллюлозных фильтрах или нейлоновых мембранах.

Изображение слайда
29

Слайд 29

Гибридизация по Саузерну ( Southern)

Изображение слайда
30

Слайд 30

Полимеразная цепная реакция ПЦР–эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Для ПЦР необходимы : Два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной 20-25 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень; их 3 ’ – ОН концы должны быть ороиентированы навстречу друг другу; ДНК-мишень длиной от 100 до 35000 п.н.; термостабильная ДНК-полимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95 и выше; четыре дезоксирибонуклеотида.

Изображение слайда
31

Слайд 31

ПЦР – многократное повторение следующих трех реакций: 1. Денатурация образца ДНК выдерживанием его при температуре 95 С в течение по крайней мере 1 минуты. Помимо ДНК в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерии Termus aquaticus и четыре dNTP. 2. Ренатурация или отжиг. Температуру смеси медленно понижают до оптимальной температуры спаривания матрицы ДНК и праймеров. 3. Синтез. Температуру повышают до приблизительно 75 С – величины, оптимальной дляДНК-полимеразы Taq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3 ’ – ОН группой праймера.

Изображение слайда
32

Слайд 32

Изображение слайда
33

Слайд 33

После 25 циклов концентрация амплифицированных фрагментов увеличивается в миллионы раз. После амплификации полученные фрагменты анализируют гель-электрофорезом. С помощью ПЦР можно вводить адапторы для создания сайтов рестрикции у амплифицированных фрагментов с дальнейшим их клонированием, например в клетках E.coli. Этот метод используют также для направленного мутагенеза.

Изображение слайда
34

Слайд 34

Общие принципы ПЦР в реальном времени ( REAL-TIME PCR ) Real-time PCR - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами: Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации. Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Изображение слайда
35

Слайд 35

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time ПЦР. R eal-time ПЦР позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Изображение слайда
36

Слайд 36

Кинетическая кривая ПЦР в координатах В ней можно выделить три стадии: 1. Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой). 2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается Экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР). 3. Плато – стадию насыщения.

Изображение слайда
37

Слайд 37

1. Использование интеркалирующих агентов. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации. Детекция с применением интеркалирующих красителей, таких как SYBR GreenandEvaGreen, не специфична к нуклеотидной последовательности, поскольку они связываются с любой двухцепочечной ДНК. Основное преимущества их применения – дешевизна.

Изображение слайда
38

Слайд 38

Выщепление 5' концевой метки (TaqManAssay). Эта методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют 3 ДНК-зонда : 2, фланкирующих (немеченные), а в состав третьего входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует Комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения.

Изображение слайда
39

Слайд 39

Цифровая ПЦР ( ddPCR, dropPCR ) – новый подход к детекции и определению количества нуклеиновых кислот. Это усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции с использованием, например, системы интеркалирующих агентов или TaqManAssay. Реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель, попадающих на лунки чипа. Чип может содержать несколько десятков тысяч ячеек, на которых в каплях протекает ПЦР. При проведении анализа отрицательные реакции также используются для подсчета абсолютного количества молекул-мишеней в образце. По завершению реакции данный чип может быть использован для проведения секвенирования или клонирования с каждой капли.

Изображение слайда
40

Слайд 40

Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) Обратная транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК. Обратную транскрипцию обнаружили в 1970 г. Темин, Балтимор, Дульбеко, работавшие с вирусом саркомы Рауса (ВСР). Это онкорнавирус (oncoRNA) – относится к ретровирусам.

Изображение слайда
41

Слайд 41

. Обычно используют фермент, кодируемый вирусом миелобластоза птиц. Он состоит из двух полипептидных цепей, одна из которых несет экзорибонуклеазную и 5’ →3’ полимеразную активность. Экзорибонуклеазная активность проявляется только в дуплексах ДНК/РНК. Как полимераза фермент работает на однонитевых молекулах РНК и ДНК, образуя комплементарные дезоксирибонуклеотидные цепи (кДНК), для чего ему требуются праймеры с 3 ’ - ОН концом.

Изображение слайда
42

Слайд 42

Получение in vitro копии структурной части гена с какой-либо мРНК (ОТ или RT ) ведут в две стадии: 1. Синтез однонитевой ДНК на матрице мРНК с помощью праймера олиго-( dT ) n либо набора случайных ( random ) праймеров. 2. Синтез двунитевой кДНК на матрице однонитевой кДНК, причем праймером служит 3 ’ -ОН конец однонитевой петли, которая образуется при окончании считывания копии с мРНК обратной транскриптазой.

Изображение слайда
43

Слайд 43

Вестерн-блоттинг Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку.

Изображение слайда
44

Слайд 44

1. Подготовка образца 2. Гель-электрофорез 3. Перенос на мембрану 4. Блокирование 5. Детекция 6. Анализ 6.1. Колориметрическая детекция 6.2. Хемилюминесцентная детекция 6.3. Радиоактивная детекция 6.4. Флюоресцентная детекция

Изображение слайда
45

Слайд 45

Метод хемилюминесцентной детекции основывается на инкубации нитроцеллюлозной мембраны с субстратом, который люминесцирует после взаимодействия с репортером вторичного антитела. Свет регистрируется фотопленкой или CCD-камерой, которая производит цифровую съемку вестерн блота. Изображение анализируется денситометрически, оценивая относительное количество окрашенного белка и даёт количественный результат в единицах оптической плотности. Новое программное обеспечение позволяет провести дальнейший анализ данных, например, определить молекулярный вес, если использовался соответствующий стандарт.

Изображение слайда
46

Последний слайд презентации: БИОТЕХНОЛОГИЯ

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию.

Изображение слайда