Презентация на тему: БИОТЕХНОЛОГИЯ

БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
1/38
Средняя оценка: 4.2/5 (всего оценок: 59)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (1129 Кб)
1

Первый слайд презентации: БИОТЕХНОЛОГИЯ

Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Направление 020400 Биология Профиль Общая биология Профессор кафедры Зоологии д.б.н., проф. Цымбаленко Надежда Васильевна

Изображение слайда
2

Слайд 2

Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах

Изображение слайда
3

Слайд 3

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, - подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Наиболее важные свойства систем экспрессии: 1. Тип промотора и терминатора транскрипции; 2. Прочность связывания мРНК с рибосомой; 3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки); 4. Конечная локализация синтезируемого продукта ; 5. Эффективность трансляции в организме хозяина; 6. Стабильность продукта в хозяйской клетке. Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует.

Изображение слайда
4

Слайд 4

Причины преимущественного использования клеток E. coli для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК: генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков

Изображение слайда
5

Слайд 5

Необходим сильный регулируемый промотор, имеющий большое сродство к РНК-полимеразе. Наиболее широко используются регулируемые промоторы lac - и trp - оперонов E. coli специально сконструированный tac -промотор, включающий -10- область lac -промотора и -35-область trp - промотора левый или, pL, промотор бактериофага λ промотор гена 10 бактериофага Т7 С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

Изображение слайда
6

Слайд 6

Функциональные модули вектора для экспрессии в прокариотах

Изображение слайда
7

Слайд 7

Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина Включение плазмидной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. Процесс интеграции состоит в следующем: 1. Идентификация подходящего сайта интеграции, т.е. сегмента хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки. 2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части.

Изображение слайда
8

Слайд 8

3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайт интеграции или вблизи него. 4. Перенос полученной генетической конструкции “хромосомный сайт интеграции/клонированный ген” в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина. 5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, которые экспрессируют клонированный ген. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.

Изображение слайда
9

Слайд 9

Схема одного из механизмов интеграции генетического материала в хромосому .

Изображение слайда
10

Слайд 10

Химерные белки Один из способов защиты продуктов экспрессии чужеродных генов (белков) от деградации в хозяйских клетках – ковалентное присоединение продукта клонированного гена к какому-либо стабильному белку хозяина. Подобная конструкция получила название “химерный белок”. Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. Рамка считывания!!! В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, что встречается нечасто.

Изображение слайда
11

Слайд 11

Общая схема типичного экспрессионного бактериального вектора

Изображение слайда
12

Слайд 12

Для удаления балластной (хозяйской) белковой последовательности из химерного белка на уровне ДНК программируют введение сайтов узнавания для протеаз. Олигонуклеотидные линкеры, несущие такие сайты, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигопептид Ile - Glu - Gly - Arg, узнаваемый фактором крови Ха, который является специфической протеинкиназой.

Изображение слайда
13

Слайд 13

Например, плазмидная конструкциия S. cerevisiae, содержащая ген человеческого интерлейкина-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид Asp - Tyr - Lys - Asp - Asp - Asp - Asp – Lys (он продается под названием Flag ), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку. Интерлейкин-2 - это биологический фактор, стимулирующий рост Т-клеток и синтез В-клеточных антител. Химерный белок, образующийся после экспрессии этой конструкции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии.

Изображение слайда
14

Слайд 14

Изображение слайда
15

Слайд 15

Создание подобных химерных конструкций широко используется также для контроля за уровнем экспрессии вводимого гена и для определения места локализации его продукта в клетке-хозяине. В этом случае последовательности гена-мишени сливают с генами, которые кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано. Они получили название – репортерные гены.

Изображение слайда
16

Слайд 16

Чаще всего в качестве репортерных используют гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и др. GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. В 2008 г. Нобелевская премия по химии была присуждена группе ученых из США: Osamu Shimomura, Martin Chalfie и Roger Tsien за "открытие и исследование зеленого флюоресцирующего белка", который стал одним из важнейших исследовательских инструментов в биологии, так как позволяет вести наблюдения за процессами в живых клетках

Изображение слайда
17

Слайд 17

Клетки линии НЕК-293, трансфецированные плазмидными ДНК, которые содержат репортерные гены зеленого (А) и красного (Б) флюоресцирующих белков Фотографии сделаны на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе “ Leica SP 2” (увеличение в 400 раз).

Изображение слайда
18

Слайд 18

Повышение эффективности секреции Стабильность белков, кодируемых клонированными генами, и простота процедуры очистки зависят от их клеточной локализации. Транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают N -концевые аминокислотные последовательности – сигнальные пептиды. Иногда удается сделать белок секретируемым, присоединив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида.

Изображение слайда
19

Слайд 19

Причины метаболических перегрузок Увеличение числа копий и/или размера плазмид и связанное с этим увеличение количества энергии. Необходимого для их репликации и сохранения. Недостаток растворенного кислорода в среде и невозможность обеспечения им и всех метаболических реакций, и процесса экспрессии плазмидных генов. Гиперпродукция чужеродных белков, приводящая к истощению пула компонентов процесса трансляции. Перегрузка системы экспорта и нарушение правильной локализации жизненно важных белков хозяйской клетки. Непосредственное влияние чужеродных белков на функционирование хозяйской. И др.

Изображение слайда
20

Слайд 20

Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем

Изображение слайда
21

Слайд 21

Проблемы производства эукариотических белков в системе прокариот: в некоторых случаях нестабильность или биологическая неактивность несмотря на тщательную очистку всегда есть вероятность загрязнения пирогенами Для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии.

Изображение слайда
22

Слайд 22

Белки в клетках эукариот претерпевают следующие посттрансляционные изменения Образование дисульфидных связей Неправильно уложенный белок может оказаться нестабильным и неактивным. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционального белка. Гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, или особые свойства. Модификация аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование и др. Выбранная эукариотическая система экспрессии проверяется на наличие необходимой системы пострансляционной модификации.

Изображение слайда
23

Слайд 23

Эукариотические экспрессирующие векторы имеют такую же структуру, что и их прокариотические аналоги и должны содержать: эукариотический селективный маркер эукариотический промотор соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции сигнал полиаденилирования мРНК Большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Челночные векторы несут два типа сайтов инициации репликации, трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционирует в E. coli, а другие – в эукариотических хозяйских клетках.

Изображение слайда
24

Слайд 24

Введение ДНК в бактериальные и дрожжевые клетки называют трансформацией. Для обозначения наследственных изменений в животных клетках после введения в них экзогенной ДНК был выбран термин трансфекция. Способы трансформации дрожжевых клеток : Экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически ( протопласты). Клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития. Электропорация.

Изображение слайда
25

Слайд 25

Системы экспрессии Sacharomyces cerevisiae Причины использования клеток дрожжей для экспрессии клонированных генов эукариот: 1. Это одноклеточный организм, генетика и физиология которого хорошо изучены, и который можно выращивать как в небольших колбах, так и в промышленных реакторах. 2. Выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих организмов, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные (2-микронные плазмиды). 3. В клетках S. cerevisiae осуществляется большое число посттрансляционных модификаций. 4. Лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой, то его очистка не составит большого труда. 5. Поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, то S. cerevisiae включили в список “организмов, признанных безопасными”

Изображение слайда
26

Слайд 26

Некоторые белки, синтезированные в S. cerevisiae, уже применяются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики: Вакцины (поверхностный антиген вируса гепатита В;белок малярийного плазмодия; белок оболочки HIV -1). Диагностика (белок вируса гепатита С; антигены HIV -1). Лекарственные вещества ( фактор роста эпидермиса; инсулин; инсулиноподобный фактор роста; тромбоцитарный фактор роста; проинсулин; фактор роста фибробластов; колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов; α-1-антитрипсин; фактор XIII а системы свертывания крови.

Изображение слайда
27

Слайд 27

Векторы для S. cerevisiae Эписомные, или плазмидные векторы широко используются для получения как секретируемых, так и несекретируемых гетерологичных белков. Однако такие системы экспрессии зачастую оказываются нестабильными при выращивании в больших (больше 10 литров) объемах. Интегрирующие векторы. Эта стратегия не получила широкого развития из-за малой копийности клонируемого гена (одна копия на хромосому) – малый выход конечного белка. Искусственные дрожжевые хромосомы ( YAC ). Эта система предназначена для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т.п.н.), которые потом поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. YAC -система очень стабильна.

Изображение слайда
28

Слайд 28

Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes –YAC) – линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов), дрожжевую центромеру, содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит – 100–1 000 тпн. Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек.

Изображение слайда
29

Слайд 29

Изображение слайда
30

Слайд 30

YAC -система клонирования содержит : 1. Селективный маркерный ген E. coli – Amp 2. Сайт инициации репликации, функционирующий в E. coli. – ori. 3. Сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки URA 3 ( один из генов биосинтеза урацила) CEN (последовательность, выполняющая центромерную функцию) TRP 1 (один из генов биосинтеза триптофана) ARS (дрожжевая автономно реплицирующая последовательность, эквивалентная дрожжевому сайту инициации репликации). 4. Т - теломерные области дрожжевой хромосомы, обеспечивающие стабильность хромосомы. 5. Sma1 – сайт клонирования.

Изображение слайда
31

Слайд 31

Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих (ЭВМ) Внехромосомные ЭВМ используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут использоваться в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека. Сконструировано большое количество таких векторов, но все они обладают сходными свойствами и похожи на другие эукариотические векторы.

Изображение слайда
32

Слайд 32

Обобщенная схема ЭВМ Полилинкер (ПЛ) и селективный маркер) (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора ( р ) и сигнала полиаденилирования или терминации ( ра ). Обычно используют регуляторные последовательности ДНК вирусов животных (например, цитомегаловируса человека, SV 40 или HSV ) или генов млекопитающих (гена β-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или гена гормона роста). Репликация в клетках E. coli и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами инициации репликации ori и ori соответственно. Для отбора трансформированных клеток E. coli используется ген устойчивости к амрициллину Amp.

Изображение слайда
33

Слайд 33

Экспрессия двух клонированных генов в одной клетке млекопитающих 1. Двухвекторная система экспрессии

Изображение слайда
34

Слайд 34

2. Экспрессирующий вектор с двумя независимотранскрибируемыми генами

Изображение слайда
35

Слайд 35

Селективные маркерные гены для высших эукариот 1. Бактериальный ген Neo, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, которая обеспечивает устойчивость трансфецированных клеток к токсичному соединению генетицин ( G -418 ) 2.Ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу ( DGFR ). В этой системе используют клетки с дефектом гена DGFR, которые не способны расти на среде с метотрексатом. Отобранные клетки пересевают на среды с большей концентрацией метотрексата, отбирая таким образом клетки, содержащие больше копий вектора. 3.Ген фермента глутаминсинтетазы ( GS ), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина.

Изображение слайда
36

Слайд 36

Направленный мутагенез Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать подход, основанный на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов свойствами. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. ( Michael Smith, Нобелевская премия – 1993).

Изображение слайда
37

Слайд 37

Два подхода сайт-направленного мутагенеза

Изображение слайда
38

Последний слайд презентации: БИОТЕХНОЛОГИЯ

Создание синтетических олигонуклеотидов для детекции или клонирования фрагментов белка с известной первичной структурой

Изображение слайда