Презентация на тему: БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747

Реклама. Продолжение ниже
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
ПЦР в реальном времени
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
Фазы ПЦР
Классификация ПЦР-РВ по способу снятия сигнала
Точки сбора данных для различных видов анализа
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
Визуализация накопления ПЦР-продукта
Интеркалирующие красители. SYBR Green
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
1/25
Средняя оценка: 4.9/5 (всего оценок: 43)
Код скопирован в буфер обмена
Скачать (725 Кб)
Реклама. Продолжение ниже
1

Первый слайд презентации

БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747 год.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
2

Слайд 2: ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени – метод, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной детекцией сигнала, генерируемого в ходе проведения ПЦР.

Изображение слайда
1/1
3

Слайд 3

ПЦР в реальном времени Обычная ПЦР

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
4

Слайд 4

Способы детекции сигнала при проведении ПЦР

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
5

Слайд 5: Фазы ПЦР

Экспоненциальная, детектируемая фаза Экспоненциальная, не детектируемая фаза Линейная фаза Фаза плато Циклы У ров е нь накопления продукта Фазы ПЦР

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
6

Слайд 6: Классификация ПЦР-РВ по способу снятия сигнала

ПЦР РВ Анализ по конечной точке. Данные снимаются с фазы плато. Используется для проведения качественных анализов. Примеры – плюс-минус анализ, анализ дискриминации аллелей. Анализ в реальном времени. Данные снимаются с экспоненциальной фазы реакций. Используется для проведения количественных анализов. Примеры – абсолютный количественный анализ, относительный количественный анализ. Классификация ПЦР-РВ по способу снятия сигнала

Изображение слайда
1/1
7

Слайд 7: Точки сбора данных для различных видов анализа

Циклы У ров е нь накопления сигнала Количественные анализы (в реальном времени) Качественные анализы (по конечной точке) Точки сбора данных для различных видов анализа

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
Реклама. Продолжение ниже
8

Слайд 8

ОТЛИЧИЕ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ПЦР «ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» И «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ» Несмотря на различие в конечной концентрации продуктов реакции, появление регистрируемого прибором сигнала для всех пробирок произошло одновременно, что свидетельствует о схожести начального количества ДНК.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
9

Слайд 9: Визуализация накопления ПЦР-продукта

Во время прохождения стандартной ПЦР не нарабатывается видимого сигнала Накопление ПЦР-продукта нужно каким-то образом визуализировать. Визуализация накопления ПЦР-продукта ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ!!!

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
10

Слайд 10: Интеркалирующие красители. SYBR Green

Связывается с малой бороздкой ДНК. Окрашивает любую двуцепочечную ДНК. Интенсивность флуоресцентного сигнала SYBR Green пропорциональна количеству наработавшегося двуцепочечного продукта реакции.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
11

Слайд 11

Достоинства интеркалирующих красителей: Дешевизна Простота в использовании Недостатки интеркалирующих красителей: -Недостаточная точность ( сигнал от димеров праймеров! ) -Невозможность проведения мультиплексной ПЦР Чтобы компенсировать эти недостатки, были придуманы системы «флюорофор – гаситель».

Изображение слайда
1/1
12

Слайд 12

А. Флюорофор связан с ДНК и флюоресцирует. Б. Флюорофор и гаситель связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия передается с флюорофора на гаситель и испускается последним с другой длиной волны (флюоресцирующий гаситель). В. Флюорофор и гаситель связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия передается с флюорофора на гаситель и диссипирует (темновой гаситель).

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
13

Слайд 13

Флюорофоры – небольшие химические соединения ароматической природы. Гасители – небольшие химические соединения ароматической природы.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
14

Слайд 14

Флюорофоров бывает много!

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
Изображение для работы со слайдом
1/3
Реклама. Продолжение ниже
15

Слайд 15

Меченые праймеры с адаптерной последовательностью («амплифлюры») а — праймер содержит 5'-адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель. При температуре элонгации инвертированный повтор образует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. В ходе синтеза второй цепи ДНК шпилечная структура «разворачивается» и интенсивность флуоресценции возрастает. б — праймер содержит меченый 5'-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи «сталкивает» олигонуклеотид с гасителем.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
16

Слайд 16

Вытесняющие пробы Вытесняющая проба - пара частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов, один из которых несет флуорофор, а другой — гаситель флуоресценции. В отсутствие мишени проба образует дуплекс, в котором флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего пробе продукта реакции процесс реассоциации пробы начинает конкурировать с процессом гибридизации олигонуклеотидов на мишень, что ведет к увеличению уровня флуоресценции. ! Проба – это не праймер! С пробы амплификация не идет, она просто с чем-нибудь связывается.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
17

Слайд 17

Молекулярные маячки ( molecular beacons – молекулярный бекон!) Пробы несут короткий инвертированный концевой повтор, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. В растворе проба формирует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. При гибридизации со специфичным продуктом реакции проба «разворачивается», что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и, как следствие, к усилению флюоресценции.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
18

Слайд 18

Вы думали, здесь будет еще один вариант флюоресцентной детекции? А вот и нет! 5 ’- экзонуклеазная активность Taq- полимеразы Активность эта «биоинженерная» - в рекомбинантный белок добавлен соответствующий домен.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
19

Слайд 19

Линейные разрушаемые пробы ( TaqMan) Пробы несут флуорофор и гаситель флуоресценции. Пока проба находится в растворе, за счет близкого расположения гаситель эффективно поглощает энергию флуорофора. В случае гибридизации со специфичным продуктом реакции проба разрушается за счет 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и возрастанию флуоресценции.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
20

Слайд 20

ПЦР в реальном времени – количественный метод! Идеальная ПЦР: n—номер цикла реакции; N0—количество целевых молекул в начале реакции (на первом цикле); Nn—количество продуктов реакции на цикле n; 2 — коэффициент эффективности ПЦР. Реалистическая ПЦР: Е – коэффициент эффективности, находящийся в интервале от 1 до 2. Отличие значения Е всего на 0,15 к 30-му циклу ПЦР дает разницу в количестве продукта в 10 раз!

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
Изображение для работы со слайдом
1/3
21

Слайд 21

Регистрируется не количество молекул ДНК, а флюоресцентный сигнал! F - сигнал флуоресценции; а - (неизвестный) коэффициент пропорциональности; N - число молекул ДНК. Коэффициент а зависит от: - настроек прибора, параметров реакционной пробирки, точности разнесения реактивов по пробиркам и т. д. системы визуализации накопления ДНК (интеркалирующие красители, олигонуклеотидные зонды, меченые праймеры и т. д.). При сравнении разных экспериментов или даже разных пробирок внутри одного эксперимента полученные данные нельзя сравнивать напрямую: коэффициент для них может отличаться.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
Изображение для работы со слайдом
1/3
22

Слайд 22

Господи Иисусе, как же все это можно посчитать?! (Да, в общем-то, довольно просто). Пороговый метод : определение момента Ct (выраженного в циклах ПЦР), когда количество ДНК в реакционной пробирке (а следовательно, и флуоресцентный сигнал) достигает одинаковой для всех образцов пороговой величины Nt (задается пользователем или программным обеспечением). Сравнивая полученные значения Ct, можно судить о начальных концентрациях ДНК в исследуемых образцах. Для корректной работы порогового метода, необходимым является сходство коэффициентов преобразования уровня флуоресценции в количество ДНК.

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
23

Слайд 23

Участки кривой накопления флюоресцентного сигнала Линейная шкала Логарифмическая шкала Информативен только экспоненциальный участок!

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
Изображение для работы со слайдом
1/3
24

Слайд 24

Сравнение нескольких реакций ПЦР пороговым методом Можно ли сделать это в одной пробирке?

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
Изображение для работы со слайдом
1/3
25

Последний слайд презентации: БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747

Мультиплексная ПЦР в реальном времени Просто добавьте зонты с разной шириной волны испускаемой тьмы к разным молекулам ДНК и используйте прибор с возможностью детекции нескольких глубин волн – и все у вас будет ништяк!

Изображение слайда
Изображение для работы со слайдом
1/2
Реклама. Продолжение ниже